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《農藥學學報》2016年第二期

摘要：

草銨膦(glufosinate-ammonium，GLA)是一種廣譜觸殺型非選擇性除草劑，隨著在生產中應用的不斷增加，其生物安全性也越來越受到人們的重視。試驗以斑馬魚Daniorerio胚胎為動物模型，用不同劑量的草銨膦染毒受精后2h的斑馬魚胚胎，觀察其死亡率和形態學變化，并應用原位雜交和QRT-PCR技術檢測了Vasa基因表達情況，以分析草銨膦的毒性作用。結果表明：1.6μg/L的草銨膦對斑馬魚胚胎有顯著致死作用、1.3μg/L的草銨膦有顯著致畸作用，其中畸形表現為尾部彎曲和阻礙黑色素沉著。原位雜交結果顯示：1.3μg/L的草銨膦可引起Vasa表達的部分缺失，QRT-PCR定量分析發現，草銨膦可引起斑馬魚胚胎Vasa基因表達水平下調3.8倍。表明草銨膦對斑馬魚胚胎有較強的致死毒性、致畸作用和潛在的生殖毒性。

關鍵詞:

草銨膦；斑馬魚；毒性評價；Vasa基因

草銨膦[(glufosinate-ammonium，圖式1)，化學名稱為4-(羥基(甲基)膦酰基)-DL-高丙氨酸]，是由德國赫斯特公司(現為拜耳公司下屬企業)于20世紀80年代創制的有機磷類廣譜觸殺型非選擇性除草劑，最早于1984年在日本獲得登記。草銨膦也是世界第二大轉基因作物耐受除草劑[1]，其特點是活性高、吸收好、殺草譜廣、低毒、持效期長、環境兼容性好[2-3]，已在日本、韓國、東南亞、歐洲、美洲等國家普遍應用?！皽缟猿輨?抗除草劑轉基因作物”的農業生產模式已逐漸成為農業生產發展的主流[4]。在草銨膦產量日益增長的同時，其安全性也引起了廣泛關注。目前，對草銨膦的研究主要集中于其在環境中的降解、轉移以及對農作物的影響等。草銨膦在土壤中活性較低、降解較快，一般降解為4-甲基膦酸亞基-2-氧代丁酸(PPO)和3-甲基膦酸亞基(MPP)，其降解及轉移與土壤的黏度成分有關[5]，氣候、水分和光照等條件亦會影響其降解[6]。草銨膦在雜草體內的作用靶點是谷氨酰銨合成酶(GS)，其作用機制是對GS不可逆的抑制及破壞其相關代謝過程，從而導致細胞內氨積累、氨基酸合成及光合作用受抑制、葉綠素被破壞等，進而引起植物死亡[7]。有關草銨膦在動物體內代謝動力學的研究表明，草銨膦被吸收后在大鼠全身大部分臟器均有分布，以尿液排出為主[8]。草銨膦易溶于水(溶解度為1379g/L)，并且在pH5~9的水體中不會光解[9]，因而在一些研究中草銨膦已被歸為持久性污染物，其半衰期為3~42d[10]。草銨膦會抑制樹蟾體內乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶的活性[11]；草銨膦染毒會誘導蟾蜍蝌蚪血液紅細胞微核率升高[9]。還有研究表明，草銨膦會造成人的DNA氧化性損傷[12]；在使用草銨膦的地區，通過飲食和飲水可對人體和動物造成危害[13–15]。隨著草銨膦的廣泛應用，其殘留物對人體健康的影響越來越受到人們的重視，開展其水生生物毒性的相關研究可以評價其對水體的安全性。斑馬魚Daniorerio是目前理想的生物模型[16-17]。本研究采用草銨膦感染早期斑馬魚胚胎，通過形態學、分子生物學以及組織學等手段，觀察評價了草銨膦對胚胎生長發育的影響。

1材料與方法

1.1儀器與試劑5415R型臺式離心機(Eppendorf公司)；數碼照相機DXM1200、倒置顯微鏡E600及EclipseNet圖像分析軟件(Nikon公司)。10%草銨膦水溶液(由Solarbio公司從德國拜耳進口分裝)；阿爾新藍；DIG抗體顯色劑(BMpurple,Roche)；抗地高辛抗體(DIG,Roche)；TrizolRNA提取試劑盒(Gibco)；反轉錄試劑盒；肝素和酵母tRNA。阿爾新藍染液：由0.1g阿爾新藍、20mL醋酸和80mL95%乙醇組成。20×氯化鈉檸檬酸鈉緩沖液(SSC)：氯化鈉17.52g，檸檬酸鈉8.84g，蒸餾水80mL；用氫氧化鈉調pH值至6.0，定容至100mL，高壓滅菌，4℃或者室溫保存。

1.2供試動物斑馬魚Daniorerio(AB系)由日本酪農學園大學贈送，飼養于北京愛生公司生產的斑馬魚養殖系統中，保持飼養水溫28.5℃、光照時間為14h/d。試驗前一天傍晚，隨機選取3條雌魚和6條雄魚放在同一斑馬魚專用孵化缸中混養，于第2日8：00開燈，待其自然交配后，挑選發育正常的受精卵置于直徑為3cm的六孔板中，在受精后2h進行草銨膦染毒。每個濃度10個胚胎，3次重復。染毒后移入孵化箱，于28.5℃下培養。分別于受精后24、48或120h取樣觀察，記錄死亡和畸形胚胎個數。

1.3試驗處理根據預試驗結果，最終確定了6個草銨膦染毒濃度處理，分別為：空白對照、0.001μg/L(微量濃度組)、1.0μg/L(低濃度組)、1.3μg/L(有畸形但未出現死亡的濃度)、1.6μg/L(開始出現死亡個體的濃度)和2.0μg/L(全部死亡組，即高濃度組)。

1.4軟骨染色參考Dong等的方法[16]。1)胚胎的固定：取受精后120h的幼魚10條，用4%的中性緩沖多聚甲醛(PFA)于4℃下固定并過夜；2)染色：用阿爾新藍染液染色6h；3)清洗：用75%和50%的酒精以及蒸餾水各清洗3h；4)祛黑色素：依次用0.05%的胰酶-飽和四硼酸鹽和1%氫氧化鉀-30%雙氧水各處理1h；5)觀察及保存：在70%甘油中觀察及保存。

1.5原位雜交及定位Vasa探針的制備采用68~509pbHSP90a的片段，引物分別為5′-CCGCAGGTGGAGAAGAGGA-3′和5′-GACAGTGAACGATCCGCCA-3′。將擴增后的基因片段插入pGEM質粒中，經過篩選、擴增、測序、酶切和純化后，在DIG標識的dNTP和T7或者SP6Ploymerase(Roche)存在的情況下，合成各自的探針。原位雜交按Dong等[16]的方法進行。取受精后24h的胚胎，于4℃下用4%的PFA固定12h；用蛋白酶K(1.0×10–6mol/L)于室溫下消化30min；加入原位雜交液(50%甲酰胺，5×SSC，2g/LtRNA，200μg/mL肝素)，于64℃恒溫箱中培養1h(預雜交)；用含有斑馬魚Vasa基因探針的原位雜交緩沖液更換過夜；分別用2×SSC、0.2×SSC在64℃加熱器中各清洗30min，再用順丁烯二酸緩沖液(0.1mol/L順丁烯二酸，0.15mol/L氯化鈉，0.1%吐溫-20，pH7.5)清洗20min，然后用封閉液(blockingbuffer：2%blockingreagent0.1mol/L順丁烯二酸，0.15mol/L氯化鈉，0.1%吐溫-20，pH7.5)在室溫下清洗1h；置于4000倍稀釋的抗地高辛抗體(DIG)中，于4℃冰箱中反應過夜；加入清洗液(0.1mol/LTris-HCl，pH9.50.1mol/L氯化鈉，0.05mol/L氯化鎂，0.1%吐溫-20靜置20min，用BMpurpleAP染色，觀察基因表達部位、范圍與強度等，對特定基因的表達進行定位，并運用CCD攝像系統進行解析。

1.6RNA的提取及定量PCR(QRT-PCR)技術總RNA的提取使用TrizolRNA提取試劑盒。取受精后24h的胚胎，分成3組，即3次重復，每個重復30粒魚卵，勻漿后，加入氯仿于4℃、12000r/min下離心10min；離心后用移液槍移取上層水相(含有RNA)到新管中，用異丙醇沉淀RNA，經80%乙醇沖洗2遍后用無核酸酶水溶解，采用多功能酶標儀測定OD260和OD28值，并計算OD260/OD280的比值，求出RNA產量轉錄采用反轉錄酶2μL、5×Buffer4μL、5mmoL/dNTP4μL、反轉錄抑制劑1μL、特異下游引物1μL和總RNA1μg，最后加無核酸酶水至20μL于42℃60min→95℃5min→冰水中冷卻5min備用。SYBRGreenIQRT-PCR方法的建立：在25μ反應體系中，加入SYBRGreenIPCR反應混合液12.5μL，Vasa上、下游引物各0.5μL，cDNA2μ(1ng)，水9.5μL；于95℃10min→95℃15s→60℃1min，40個循環。內參基因為β-Actin，采用2-ΔΔCT方法計算基因表達的相對變化。

1.7統計方法數據用SPSS統計軟件在單因素方差分析方法中進行多重比較。結果以平均值±標準誤差表示差異顯著性水平設置為P<0.05。

2結果與分析

2.1草銨膦對斑馬魚胚胎及仔魚的致死作用用草銨膦染毒受精后2h的斑馬魚胚胎，于受精后第120小時取樣觀察發現，隨草銨膦處理濃度升高，各處理間死亡率存在差異。其中對照組、0.001、1.0、1.3、1.6和2μg/L濃度組的死亡率分別為13.3%、10%、10%、13.3%、60%和100%(圖1)，且1.6和2.0μg/L處理間存在顯著差異，這兩組與其他處理間也存在顯著差異。

2.2草銨膦對斑馬魚胚胎和仔魚形態的影響草銨膦可引起斑馬魚胚胎黑色素沉著障礙和仔魚尾部彎曲(圖2)。在受精后2h用草銨膦進行染毒，于受精后120h記錄。對照組、0.001、1.0、1.3和1.6μg/L濃度組畸形率分別為0、0、0、70%和40%；2μg/L濃度組全部死亡(圖3)。草銨膦可誘導斑馬魚仔魚尾部彎曲(圖4)。用草銨膦染毒受精后2h的斑馬魚胚胎，于受精后120h取樣觀察發現，對照組、0.001和1.0μg/L濃度組尾部彎曲率均為0；1.3μg/L濃度組尾部彎曲率平均為70%；1.6μg/L濃度組尾部彎曲率平均為23.3%；2.0μg/L濃度組全部死亡(圖5)。高濃度草銨膦可阻礙斑馬魚胚胎的黑色素沉著(圖2D)。用草銨膦染毒受精后2h的斑馬魚胚胎，于受精后48h取樣觀察(圖6)發現：對照組、0.001和1.0μg/L濃度組無黑色素沉著；1.3μg/L濃度組無黑色素沉著率平均為23.3%；1.6μg/L濃度組無黑色素沉著率平均為40%；2.0μg/L濃度組全部死亡。

2.3草銨膦對斑馬魚Vasa基因表達的影響Vasa基因是斑馬魚原始生殖細胞相關基因，本研究采用1.3μg/L(有畸形但未出現死亡的濃度)和0.001μg/L(微量濃度)，在受精后2h染毒，于受精后24h取樣，每個處理取10枚魚卵固定，進行原位雜交，圖7中紫色為Vasa基因。與對照組相比，0.001μg/L低濃度組沒有明顯的Vasa基因表達被抑制現象(圖7)，但1.3μg/L濃度組有明顯的Vasa基因表達被抑制現象。進一步應用QRT-PCR進行了定量測定。0、0.001和1.3μg/L3個處理從受精后2h染毒至受精后24h，收集魚卵提取總RNA轉錄cDNA，以β-Actin為內參基因，發現經0.001和1.3μg/L草銨膦處理后，在受精后24h可引起Vasa基因表達分別下調1.2和3.8倍(圖8)。表明草銨膦具有潛在的生殖毒性。

3結論與討論

目前，尚未見關于草銨膦對斑馬魚毒性的研究報道。本研究用不同濃度草銨膦染毒受精后2h的斑馬魚胚胎，檢測了草銨膦的致死毒性、致畸作用和潛在的生殖毒性，并評價了其毒性作用。結果顯示，草銨膦致死濃度范圍窄，于受精后2h染毒，當其質量濃度為1.3μg/L時，斑馬魚無死亡，而當其質量濃度升高到2.0μg/L時，斑馬魚全部死亡。另有研究顯示，草銨膦能特異性誘發小鼠神經上皮細胞凋亡[18]，并且細胞凋亡發生在小鼠神經上皮細胞中的腦泡細胞和神經管中，而不是間質細胞[19]。還有研究發現，產前和產后的小鼠經低濃度草銨膦暴露會造成神經損傷并誘導自閉癥的產生[20]。這些都表明草銨膦對小鼠具有神經毒性。在草銨膦的致畸作用方面尚缺少相關報道，在小鼠試驗中沒有發現其致畸作用[21]，這與本試驗中草銨膦可引起斑馬魚尾部彎曲和抑制黑色素沉著的結果不符，原因可能是由于供試動物和試驗方法不同。本試驗還發現，尾部彎曲和抑制黑色素沉著不一定同時發生在同一條魚身上，其中有一部分魚只出現尾部彎曲現象而黑色素沉積正常，而另外一部分魚無黑色素沉積但尾部正常。在生殖毒性方面，已明確草銨膦會引起小鼠胚胎著床障礙[21]。本研究中用草銨膦1.3μg/L于受精后2h染毒，24h取樣通過原位雜交和QRT-PCR技術，可監測到斑馬魚Vasa基因表達受到抑制，該結論與文獻報道相符，從而印證了草銨膦對斑馬魚胚胎具有生殖毒性。

作者：王豐 陳形 楊達漢 楊景峰 康桂英 趙寶全 李小滿 蒲韻竹 鄭娜 董武 單位：內蒙古民族大學 動物科技學院 軍事醫學科學院 毒物藥物研究所 中國科學院 東北地理與農業生態研究所 中國科學院 近代物理研究所