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摘要：比較不同來源蒲公英提取物對蘆丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、異鼠李素5種黃酮物質的高效液相色譜法檢測及蒲公英來源對其黃酮物質含量的影響。采用BREEZE-C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm),流動相A為0.25%乙酸水溶液;流動相B為90%甲醇水溶液,梯度洗脫,流速0.75mL/min,DAD檢測波長283nm;柱溫40℃。檢測方法顯示,5種黃酮物質的檢測線性范圍為0.02~500mg/L;檢出限(S/N=3)在0.002~0.04mg/kg;在加標濃度10.0,20.0和50.0mg/kg時,加標回收率(n=6)在86.25%~107.10%,檢測方法靈敏有效。檢測結果表明,不同來源蒲公英得到的蒲公英提取物中蘆丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、異鼠李素5種蒲公英提取物黃酮物質總含量以江蘇徐州產蒲公英提取物最高。

關鍵詞：蒲公英提取物;木犀草素;黃酮物質;高效液相色譜

蒲公英（TaraxacummongolicumHand.-Mazz.）為菊科蒲公英屬多年生草本植物的干燥全草，別稱浦蒲丁、婆婆英、黃花地丁、奶汁草等，蒲公英始載于《唐本草》，為臨床常用中藥，有清熱解毒，消腫散結，利尿通淋之功效，主產于歐洲、北美等地[1-3]。蒲公英在中國有70種，廣泛分布于華北、西北、東北、華東、華中及西南各省份，其中以西南和西北地區相對較多。蒲公英資源豐富，來源廣泛，是中國常見的野生蔬菜和中草藥，其中用于藥用來源的至少有27種，最常見的是蒙古蒲公英、熱河蒲公英、堿地蒲公英、東北蒲公英、反苞蒲公英、興安蒲公英等6種。蒲公英味苦，性寒，無毒，入肝徑、胃經，具有良好的清熱解毒、抑菌抗炎、利膽保肝、降血糖、降血脂等作用；蒲公英化學成分復雜，主要含有黃酮類、多糖類、色素類、有機酸類物質[4-7]。研究發現，蒲公英中的有效成分具有提高機體免疫力、抗菌、抗病毒、抗寄生蟲、抗腫瘤、延緩衰老等作用，被廣泛應用于藥理、臨床、食品、保健品等領域。蒲公英黃酮類化合物更具有增強心血管功能、增強免疫力、抗腫瘤、延緩衰老、抗氧化、降血脂、降血糖等功效，還能減少病毒性心肌炎心肌細胞凋亡，近幾年成為研究熱點，很多學者對植物蒲公英中黃酮類化合物的提取進行大量研究[8-11]。蒲公英中的活性黃酮類物質包括蘆丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、異鼠李素等，以不同產地，包括四川、福建、廣東、江西等地種蒲公英藥材為研究對象，對其中的各成分進行測定，對其功效組分的解析及功能的進一步利用，仍有待研究[3,12]。目前，對于蒲公英提取物中蘆丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、異鼠李素的測定方法主要有重量法、高效液相色譜法、分光光度法、毛細管電泳法、薄層色譜法、化學發光分析法等，分光光度法用于測定單一黃酮物質的量或濃度，估算混合物或提取物中總黃酮物質含量，不能對各種黃酮物質分別定量；薄層色譜法和柱層析法能對黃酮物質進行分離，成本低廉，但分析時間長、只能半定量、重復性差；高效液相色譜法具有分離效能高、分析速度快、樣品用量少等優點，是目前應用最廣也最適用于黃酮物質的分離測定方法[12]。采用高效液相色譜、梯度洗脫及靈敏度更高的DAD檢測建立蒲公英提取物中5種黃酮物質的測定方法，并對其精確度、回收率等進行評價；比較不同來源蒲公英提取物對其5種黃酮物質含量的影響，以期為蒲公英提取物利用提供依據。

1材料與方法

1.1儀器與材料美國瓦里安PROSTAR230高效液相色譜儀（配有輸液泵、自動進樣器、柱溫箱、在線脫氣裝置及化學工作站）；離心機（科大創新股份有限公司）；200g搖擺式高速萬能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；渦流混合器；電熱鼓風干燥箱（上海一恒公司）；AL2002電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；0.45μm及0.22μm針頭微孔濾膜過濾器；Biocel型密理博超純水系統（美國密理博公司）。乙酸、甲醇（色譜純，美國TEDIA公司）。

1.2標準溶液及流動相的制備黃酮物質標準品：蘆丁（純度≥98.0%）、槲皮素（純度≥98.0%）、木犀草素（純度≥98.0%）、山奈酚（純度≥98.0%）、異鼠李素（純度≥98.0%），均購于Flucker公司。標準品儲備液：以密理博超純水配制0.1mg/mL黃酮物質標準品濃度，并于4℃冰箱儲存；分別取以上標樣液，用密理博超純水配制成終質量濃度分別為0.1，0.5，1.0，10.0，100.0，200.0，500.0和1000.0mg/L標準品工作液，于4℃冰箱儲存。流動相A相：0.25%乙酸水溶液；流動相B相：90%甲醇水溶液。

1.3色譜分析條件BREEZE-C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），采用梯度洗脫，洗脫程序為：0~5.0min，90%~80%A；5.0~35.0min，80%~0%A；35.0~40.0min，0%~90%A。進樣量5.0μL；流速0.75mL/min；DAD檢測波長283nm；柱溫40℃。

1.4蒲公英提取物樣品處理蒲公英提取物的配制：分別稱取水提法得到的江蘇徐州產蒲公英提取物、湖北仙桃蒲公英提取物、河南三門峽產蒲公英提取物、安徽池州產蒲公英提取物各2.0000g，用40mL90%甲醇水溶液，溶解于100mL的棕色容量瓶中，置于搖床上震蕩提取40min；靜置10min，將有機相層轉移并在25℃定容到100mL后，儲存于1℃~4℃的冰箱，用前稀釋到所需濃度。

1.5供試樣品溶液的制備將得到的提取液以濾紙過濾，濾液用90%甲醇水溶液定容于25mL容量瓶，搖勻后0.45μm濾膜過濾，10000r/min離心10min后用高效液相色譜分析，外標法定性定量分析。

2結果與討論

2.1標準品和供試樣品色譜圖基于該方法的色譜條件結合DAD檢測器對5種黃酮類物質標樣進行最大吸收光譜掃描，掃描波長190~400nm。分析不同黃酮類物質的最大吸收光譜，5種黃酮類物質在283nm左右均有較大吸收峰，因此，選取283nm作為黃酮類物質的定量檢測波長。按照方法提供的液相色譜分離和分析條件，分別精密吸取標準品溶液和江蘇徐州產蒲公英提取物、湖北仙桃蒲公英提取物、河南三門峽產蒲公英提取物、安徽池州產蒲公英提取物供試樣品溶液各5.0μL，自動進樣器進樣，分析結果如圖1所示。結果表明，在色譜條件下，色譜峰尖銳，各相鄰色譜峰之間的分離度均大于1.4，理論塔板數均大于3100，滿足黃酮類物質定量要求。

2.2檢測方法學考察

2.2.1線性范圍及檢出限精密吸取混合標準品溶液，分別稀釋0，5，10，20，50和100倍，吸取6種濃度的標準品各5.0μL進行測定。以各色譜峰峰面積積分值（Y）對其濃度（X）進行線性回歸。結果顯示5種成分至少在0.02~500mg/L的線性范圍內線性關系良好（r＞0.9900），檢出限（S/N=3）為0.002~0.04mg/kg，回歸方程、相關系數。

2.2.2精密度試驗精密吸取5.0μL標準品，連續進樣6次，分別記錄5種組分的峰面積，計算得蘆丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、異鼠李素的RSD（n=6），分別為1.14%，3.62%，2.92%，2.41%和2.67%，表明儀器精密度良好。2.2.3穩定性試驗取江蘇徐州產蒲公英提取物供試樣品溶液，在0~24h內每隔2h進樣1次，分別記錄5種組分的峰面積，計算得蘆丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、異鼠李素的RSD（n=6），分別為1.37%，2.80%，3.97%，3.60%和1.44%，表明供試樣品溶液中5種組分在24h內穩定。

2.2.4重復性試驗精密稱取6份江蘇徐州產蒲公英提取物樣品，制備供試樣品溶液，在高效液相色譜下測得蘆丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、異鼠李素的RSD（n=6），分別為2.03%，3.24%，2.69%，1.38%和3.26%，表明該方法重現性良好。

2.2.5加標回收率試驗取6份江蘇徐州產蒲公英提取物（蘆丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、異鼠李素濃度分別是104.60，12.69，9.55，34.85和17.22mg/kg，總計黃酮物質含量為178.91mg/kg），每份2.00g，精密稱定，置于50.0mL具塞錐形瓶中，分別精密加入3個不同濃度的蘆丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、異鼠李素標準品（10.0，20.0和50.0mg/kg），制備供試樣品溶液，在高效液相色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果如表2所示，在加標濃度10.0，20.0和50.0mg/kg條件下，蘆丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、異鼠李素的平均回收率（n=6）分別為106.39%，100.88%，101.36%，89.45%和87.26%，檢測方法靈敏有效。

2.3實際樣品檢測結果分別取蒲公英提取物樣品，制備供試樣品溶液，在高效液相色譜下進樣測定，計算5種組分的含量，結果見表3。從表3可以看出，不同蒲公英提取物中蘆丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、異鼠李素總含量由高到低為：蒲公英（江蘇徐州）＞蒲公英（湖北仙桃）＞蒲公英（河南三門峽）＞蒲公英（安徽池州）。

3結論

試驗采用高效液相色譜法同時測定蒲公英提取物及不同來源得到的蒲公英提取物中蘆丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、異鼠李素5種黃酮物質含量，初步比較不同提取方法對5種黃酮物質含量的影響。檢測方法顯示，5種成分至少在0.02~500mg/L的線性范圍內線性關系良好（r＞0.9900）；檢出限（S/N=3）為0.002~0.04mg/kg，加標回收率為86.25%~107.10%，檢測方法靈敏有效。相對而言，江蘇徐州產蒲公英提取物的功效最為明顯，這與試驗對黃酮物質中含量的測定結果一致。

參考文獻：

[1]趙守訓,杭秉倩.蒲公英的化學成分和藥理作用[J].中國野生植物資源,2001(3):1-3.

[2]黃昌杰,林曉丹,李娟,等.蒲公英化學成分研究進展[J].中國現代中藥,2006(5):32-33,35.

[3]李詩語,沈明浩.不同采收期蒲公英中功效成分的含量變化[J].吉林農業大學學報,2013(4):438-441.

作者：王文斌 單位：安徽中煙工業有限責任公司技術中心