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《貴州師范大學(xué)學(xué)報》2016年第5期

摘要:

研究了培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、初始pH、搖床轉(zhuǎn)速對金釵石斛液體懸浮培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明，在培養(yǎng)條件分別為培養(yǎng)溫度為25℃、培養(yǎng)天數(shù)為30d、初始pH為6、搖床轉(zhuǎn)速為120r/min時，金釵石斛原球莖增殖量最大，石斛堿的積累量也相對最高。

關(guān)鍵詞:

金釵石斛;懸浮培養(yǎng);培養(yǎng)條件;增殖;生物堿

石斛屬是蘭科植物中較大的屬，全世界約有1100種，廣泛分布于亞洲、歐洲和大洋洲等地。目前供作藥用的石斛屬植物約有30多種。石斛的主要化學(xué)成分是生物堿、多糖、氨基酸、酚類、萜類、甾體及揮發(fā)油等［1］。在我國的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，石斛為常用貴重藥材，藥用歷史悠久，具有滋陰清熱、生津益胃、潤肺止咳等功效［2，3］，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，石斛還具有降血糖［4］、抗腫瘤、抗衰老、增強(qiáng)人體免疫力和擴(kuò)張血管等作用［5，6］，石斛的藥理與其所含有的石斛堿密切關(guān)聯(lián)。金釵石斛作為貴州省四大主要中藥材之一，其資源的再生產(chǎn)對于我省中藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要。利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)藥用成分可以在人工條件下進(jìn)行，通過操作培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方式能極大地提高生產(chǎn)率，在較短時間內(nèi)獲得大量的目標(biāo)產(chǎn)物，既節(jié)省耕地，又解決了原料來源;既保護(hù)了生物多樣性，又可實現(xiàn)我國中藥資源的保護(hù)和中藥產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。本研究以金釵石斛為材料，對其在懸浮培養(yǎng)方面應(yīng)用生物技術(shù)手段生產(chǎn)石斛堿有用次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行探討，得出適合石斛堿懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長和石斛堿積累的較佳搖瓶培養(yǎng)工藝條件，旨在對發(fā)酵罐中試放大培養(yǎng)石斛生產(chǎn)石斛堿提供研究基礎(chǔ)。

1材料及方法

1．1供試材料

金釵石斛采自貴州省赤水市旺隆鎮(zhèn)的野生金釵石斛，種子為野生果實，金釵石斛莖段為經(jīng)馴化后移栽到貴州師范大學(xué)生命科學(xué)院溫室，以栽培存活2年后的莖段為外植體培養(yǎng)再生植株。

1．2金釵石斛原球莖增殖統(tǒng)計方法

用“稱重法”對試驗材料進(jìn)行稱量(單位:g)，在稱量的同時觀察記錄石斛原球莖的生長狀態(tài)。增殖系數(shù)能較好地反應(yīng)原球莖的增殖狀況，增殖系數(shù)=(培養(yǎng)后重量—接種量)/接種量。

1．3培養(yǎng)條件優(yōu)化

石斛懸浮培養(yǎng)過程中可以控制反應(yīng)條件，如基本培養(yǎng)基、激素種類［7，8］和濃度、培養(yǎng)條件等來達(dá)到最優(yōu)懸浮培養(yǎng)條件。本實驗通過控制懸浮培養(yǎng)培養(yǎng)天數(shù)、搖床轉(zhuǎn)速、搖床的溫度、初始pH等條件，以增重量和石斛堿含量為衡量指標(biāo)篩選最優(yōu)液體懸浮培養(yǎng)條件。

1．4生物堿的測定

石斛堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:以石斛堿濃度為橫坐標(biāo)，620nm處吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品總生物堿含量測定:精密稱取上述各石斛樣品粉末0.5g，加濃氨水適量，加氯仿10mL，60℃回流提取2h，冷卻后補(bǔ)充氯仿至原重，抽濾得到生物堿提取液［9］。按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法測定吸光度，計算總生物堿的含量。

2結(jié)果與討論

2．1不同發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間對金釵石斛懸浮培養(yǎng)的影響

用“稱重法”對試驗材料進(jìn)行稱量(單位:g)，在稱量的同時觀察記錄石斛原球莖的生長狀態(tài)。增殖系數(shù)能較好地反應(yīng)原球莖的增殖狀況，增殖系數(shù)=(培養(yǎng)后重量—接種量)/接種量。選取相同條件下生長良好的原球莖，以1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，控制懸浮培養(yǎng)溫度，分別設(shè)定為22℃、25℃、28℃、31℃4個溫度梯度，分別于懸浮培養(yǎng)第10d、20d、30d、35d、40d，取樣稱重，計算增殖系數(shù)，并對相應(yīng)生物堿含量進(jìn)行測定。結(jié)果見表1。從表1可知:溫度不同對石斛懸浮培養(yǎng)的影響比較顯著，31℃時，石斛的增殖系數(shù)最小，在培養(yǎng)超過20d后，增殖系數(shù)積累量逐漸下降，而生物堿積累量幾乎不變;當(dāng)溫度為25℃時，隨著發(fā)酵天數(shù)的延長，石斛增殖系數(shù)增大，到培養(yǎng)30d的時候，增殖系數(shù)達(dá)到最大，為1．114，但是此溫度下生物堿的積累卻在發(fā)酵35d時達(dá)到最大，為81.78mg/L，與此溫度下培養(yǎng)30天相比差距不大，從成本考慮，選擇培養(yǎng)天數(shù)為30d為最優(yōu)，也基本可以看出，石斛原球莖增殖越多，生物堿也相對越多，基本呈正相關(guān)，在后面的培養(yǎng)中主要以石斛原球莖增殖量為衡量指標(biāo)。

2．2初始pH對石斛懸浮培養(yǎng)石斛生物量積累的影響

選取相同條件下生長良好的原球莖，以1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選擇懸浮培養(yǎng)溫度為25℃，培養(yǎng)初始pH分別為5、6、7、8，培養(yǎng)天數(shù)為20d，按2.1方法稱重，計算增殖量。從表2可以看出，在同為在溫度為25℃，培養(yǎng)天數(shù)30d的情況下，初始pH對石斛懸浮培養(yǎng)影響很大，過酸或過堿都不利于石斛細(xì)胞的生長，在pH為6的情況下，石斛生物量積累最快。

2．3搖床轉(zhuǎn)速對石斛懸浮培養(yǎng)石斛生物量積累的影響

選取相同條件下生長良好的原球莖，以1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選擇懸浮培養(yǎng)溫度為25℃，培養(yǎng)初始pH分別為6，培養(yǎng)天數(shù)為20d，設(shè)定搖床轉(zhuǎn)速為100r/min、120r/min、140r/min、160r/min、180r/min。按2.1方法稱重，計算增殖量。從表3可以看出，當(dāng)轉(zhuǎn)速為120r/min時，石斛生長最好，這與別人做其他植物懸浮培養(yǎng)選定的轉(zhuǎn)速一樣，說明植物培養(yǎng)轉(zhuǎn)速不宜過快，過快導(dǎo)致耗氧量增加，營養(yǎng)物質(zhì)損耗快。

3結(jié)論

石斛作為珍貴藥材，藥用歷史悠久，藥用成分豐富，能治療多種疾病，石斛人工栽培技術(shù)近年來被廣泛用于生產(chǎn)石斛活性物質(zhì)。但人工栽培石斛因生產(chǎn)周期過長、病害嚴(yán)重等原因而受到限制，因此，近些年來，植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)不斷被用于藥用植物生產(chǎn)，已成為目前最有潛力進(jìn)行藥用植物快速繁殖的途徑。其主要是通過外植種子(莖)體誘導(dǎo)原球莖，再進(jìn)行懸浮培養(yǎng)從而建立快速繁殖體系。由于本研究原有的研究基礎(chǔ)上已經(jīng)確定了金釵石斛懸浮培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑、碳源、天然添加物等因素，故本實驗主要對金釵石斛懸浮培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明搖瓶最佳懸浮培養(yǎng)條件是:培養(yǎng)溫度為25℃、培養(yǎng)天數(shù)為30d、初始pH為6、搖床轉(zhuǎn)速為120r/min。

參考文獻(xiàn):

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作者:牛曉娟 林夢瑩 楊德彩 張宇斌 單位:貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院