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摘要:采用華北地區(qū)濃香型白酒企業(yè)的窖泥為實(shí)驗(yàn)材料,對其理化性質(zhì)及微生物菌群進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn):隨著窖齡的增長,窖泥中的水分前五年下降較快,隨后呈緩慢下降趨勢,最終穩(wěn)定在33%左右,而且窖壁泥的含水量小于窖底泥;窖泥的pH為5.0~7.0,且窖壁泥的pH小于窖底泥pH;窖泥土壤有效磷、速效鉀等物質(zhì)隨著窖齡的增長也呈增加趨勢。采用高通量分析,研究窖泥樣品中微生物的群落結(jié)構(gòu),解析濃香型白酒不同窖齡窖泥中優(yōu)勢微生物和特征微生物,為人工窖泥的培養(yǎng)、濃香型白酒質(zhì)量的提高提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞:濃香型白酒;理化性質(zhì);窖泥微生物;高通量測序

窖泥是濃香型酒品質(zhì)的保障。研究窖泥的理化性質(zhì),改善微生物的發(fā)酵環(huán)境,為白酒的釀造提供品質(zhì)保障。此外,窖泥中微生物的種類、數(shù)量、種群間的相互作用及代謝的多樣性同樣影響著白酒的品質(zhì)[1]。隨著科技的發(fā)展,涌現(xiàn)出了許多研究窖池環(huán)境微生物的新方法。本文運(yùn)用高通量測序技術(shù),建立了一套分析窖泥細(xì)菌群落的方法,準(zhǔn)確、完整解析了濃香型白酒的窖泥中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu),為窖泥中微生物菌群的研究提供了理論依據(jù)。

1材料與儀器

1.1樣品來源

窖泥樣品來源于華北地區(qū)某酒廠。

1.2試劑及儀器

1.2.1試劑細(xì)菌總DNA提取試劑盒購,自北京天根生化科技公司;TaqMasterMix,購自南京諾唯贊生物科技有限公司;SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒,購自上海生工股份有限公司;DNAMarker2000,購自南京諾唯贊生物科技有限公司。1.2.2儀器離心機(jī)(TGL-16B);電泳儀(BG-Power600i);PCR儀(MG-96G);紫外凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD);MettlerToledopH計(jì)。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1窖泥取樣方法

分別從0、5、10、15、20、30年的窖池的壁和底部不同位置采用五點(diǎn)取樣法取10g酒窖用泥。

2.2理化指標(biāo)檢測方法

2.2.1pH將新鮮窖泥與超純水1∶3(W/V)比例混合均勻,然后用pH計(jì)測定其pH。2.2.2含水量新鮮窖泥在105℃條件下烘干2h,根據(jù)窖泥樣品烘干前后的質(zhì)量差計(jì)算樣品含水量[2-3]。2.2.3速效鉀和有效磷速效鉀檢測方法:火焰光度法[4],用mg/kg表示;有效磷檢測方法:0.5mol/LNaHCO3浸提-鉬銻抗比色法。

2.3高通量測序

2.3.1供試樣品華北地區(qū)北部某酒廠窖齡分別為5年和15年的窖中泥、窖壁泥和窖底泥,每個(gè)樣品取樣采用五點(diǎn)混合并混勻的方式,樣品置于4℃的冰箱中儲存。6個(gè)樣品及其編號見表1。2.3.2土壤細(xì)菌總DNA提取分別取等量(0.3g)窖泥樣品,使用土壤基因組DNA提取試劑盒提取總DNA,每個(gè)樣品提取3個(gè),保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。總DNA于-20℃下冷凍保存?zhèn)溆谩?.3.3樣品16SrDNAV3可變區(qū)的擴(kuò)增和高通量測序選用細(xì)菌16SrDNA通用引物,對樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系:TaqMasterMix10μL、模版1μL、正反引物各0.5μL,用DDH2O(雙蒸水)補(bǔ)足20μL。反應(yīng)條件:94℃變性10min;94℃40s、58℃30s、72℃30s,30次循環(huán);72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收,基因測序由中科院成都生物研究所通過上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行高通量測序完成。

3結(jié)果與討論

3.1窖泥pH的變化

pH是影響環(huán)境微生物生理代謝活動的重要指標(biāo),與功能菌的生長有密切關(guān)系。隨著窖泥窖齡的增長,其pH會出現(xiàn)不同程度的變化。pH太高或者太低都會影響微生物新陳代謝,因此維持適合產(chǎn)香功能菌生長的窖泥pH的穩(wěn)定顯得尤為重要。按窖泥取樣方法,分別從窖池的壁和底部取樣,按2.2.1方法測定窖泥的pH,結(jié)果見圖1。由圖1可知,窖壁泥的pH會隨著窖齡的增長呈現(xiàn)下降的趨勢,由最初的pH7的中性窖泥慢慢變成酸性,最終會維持在pH5左右;而窖底泥的pH則會由中性變?yōu)槠珘A性,從最初的pH7變?yōu)閜H7.5。窖壁泥和窖底泥的pH變化有差異:窖壁泥pH在下降,這是因?yàn)榻驯谀嗤笟庑暂^好,含氧量相對較高,由于某些不當(dāng)操作,導(dǎo)致常年使用的窖壁泥滋生大量的乳酸菌,產(chǎn)生過多的乳酸,導(dǎo)致pH下降;而窖底泥pH較為穩(wěn)定,且隨著時(shí)間的積累表現(xiàn)為中性偏弱堿性。該研究結(jié)果與張宿義等[5]、景曉衛(wèi)等[6]報(bào)道的基本一致。土壤細(xì)菌數(shù)量與pH呈顯著正相關(guān),中性pH和較高水平的生物多樣性有利于生態(tài)功能的正常發(fā)揮。因此,窖底泥偏中性pH的環(huán)境可能更有利于白酒發(fā)酵生產(chǎn),這在一定程度上可解釋為何下層酒糟所產(chǎn)白酒酒質(zhì)往往優(yōu)于上層酒糟。

3.2窖泥含水量的比較

水在白酒釀造過程中具有舉足輕重的作用,對窖泥來說尤為重要。窖泥含水量過高會導(dǎo)致窖泥掛壁難甚至垮窖,水分缺失又會導(dǎo)致窖泥板結(jié)、鹽類析出、窖泥中部分微生物死亡,最終導(dǎo)致窖泥老化[7-9],嚴(yán)重影響生產(chǎn)。按窖泥取樣方法,分別從不同窖齡的窖池的壁和底部取樣,按2.2.2方法測定窖泥的含水量,結(jié)果由圖2可知,五年窖齡的窖壁泥和窖底泥含水量下降較快,而隨著窖齡的增長,含水量呈緩慢下降趨勢,最終窖泥的最佳含水量為33%左右。窖壁泥的含水量略低于窖底泥,推測其原因,可能是在生產(chǎn)過程中物料反復(fù)出入窖池,導(dǎo)致窖壁泥水分蒸發(fā)。此外,窖泥含水量雖是一個(gè)重要指標(biāo),但其檢測結(jié)果受較多因素影響,如:不同地區(qū)、不同酒廠生產(chǎn)工藝差別較大,黃水的不同提取方式以及提取時(shí)間、黃水坑在窖池中的分布位置和窖泥取樣的時(shí)間等,都會對窖泥含水量測定結(jié)果造成影響。

3.3窖泥土壤中的有效磷和速效鉀的含量變化

窖泥的品質(zhì)與多種無機(jī)鹽有關(guān)。磷、鉀是微生物生長繁殖以及生理代謝不可缺少的微量元素,其含量過高或過低對酒質(zhì)均有影響。窖泥中的有效磷不僅是窖泥微生物繁殖的必需物質(zhì),又是合成蛋白質(zhì)的重要物質(zhì)[10]。磷是參與乙醇、乙酸合成己酸的重要物質(zhì),所以窖泥中速效磷含量不僅影響己酸菌的數(shù)量,而且影響濃香型酒主體香味物質(zhì)己酸乙酯的產(chǎn)率。窖泥中的有效鉀主要是指水溶性鉀,是微生物必需的無機(jī)鹽[11-12]。按窖泥取樣方法,分別從不同窖齡的窖池的壁和底部取樣,按2.2.3方法測定窖泥中有效磷和速效鉀含量,結(jié)果見圖3。圖3窖泥中的有效磷、速效鉀含量變化圖由圖3可知:隨窖齡的增長,窖泥中的有效磷和速效鉀含量都會上升,而且窖壁泥中的速效鉀在15~30年升高較快;同一窖齡窖池的窖底泥中速效鉀含量高于窖壁泥,這是因?yàn)樯a(chǎn)過程中酒醅、酒曲和水的循環(huán)使用使得窖泥中有效磷和速效鉀含量累積增加。隨著窖齡的增加,窖泥組成和微生物菌系不斷變化,窖泥生態(tài)環(huán)境逐漸適合微生物的生長繁殖,窖泥微生物逐步增多,窖泥和微生物互相影響、互相促進(jìn),使窖泥中有效磷和速效鉀含量不斷上升,進(jìn)一步提高了窖泥質(zhì)量。

3.4窖泥微生物種群群落組成分析

目前,對不同窖齡窖泥中活性微生物演替規(guī)律研究較多[13],對不同性狀窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)差異研究較少。高通量測序技術(shù)以其成本低、通量高、信息豐富等特點(diǎn)普遍應(yīng)用于窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)研究[14]。對5年和15年窖齡的窖壁、窖中和窖底泥,按窖泥取樣方法取樣,通過高通量測序,從門水平和屬水平分析群落組成及豐度,結(jié)果如圖4、圖5所示。72高通量測序結(jié)果顯示:窖泥相關(guān)細(xì)菌歸屬于19個(gè)門。對門水平上相對豐度前20位的細(xì)菌分析,結(jié)果如圖5所示。兩種年限窖泥中優(yōu)勢菌門主要有兩個(gè):Firmicutes(硬壁菌門)和Proteobacteria(變形菌門)。其中Firmicutes為絕對優(yōu)勢菌門(71.8%~97.6%),樣品JSJB2中Proteobacteria比例最高(2.9%)。在屬水平,豐度排名前二十的細(xì)菌分布如圖6所示。年限不同的窖池中,主要菌屬是有所不同的。在5年窖池中優(yōu)勢菌屬有:Lysinibacillus(桿菌屬)占59.6%~71.3%,Clostridium_sensu_stricto_1(梭菌屬)占12.7%~14.9%,Clostridium_sensu_stricto_13占4.3%~5.5%。且各菌屬在不同部位比例相差不大。在15年窖池中優(yōu)勢菌屬有:Clostridium_sensu_stricto_12占20.6%~56.5%,Virgibacillus(硫胺素芽孢桿菌屬)占21.9%~38.2%,Clostridium_sensu_stricto_1占1.9%~9.2%。其中Clostridium_sensu_stricto_12在窖底泥中的比例最高,Clostridium_sensu_stricto_1在窖底泥中比例最低。可見,15年窖池窖底泥中菌屬比例較另外兩種樣品差異比較大。

4結(jié)論與展望

通過對華北地區(qū)濃香型白酒企業(yè)窖泥的理化性質(zhì)和微生物種群進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)隨著窖齡的增長,窖壁泥中的含水量和pH均有不同程度的下降,而有效磷和速效鉀的含量均有不同程度的上升。采用高通量測序,從門水平和屬水平解析了5和15年窖齡窖泥的微生物種群,發(fā)現(xiàn)同一窖齡的不同位置的窖泥中微生物的差異性不大,但隨著窖齡的增長,窖泥中的微生物的豐富度有明顯提高。濃香型白酒的品質(zhì)與窖泥息息相關(guān)。由于窖泥中微生物的復(fù)雜性,需要利用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段對生產(chǎn)過程中的不同窖池窖泥中功能微生物的多樣性進(jìn)行詳細(xì)研究,以期更好地指導(dǎo)白酒生產(chǎn),提高濃香型白酒的品質(zhì)。

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作者：李俊輝 張志偉 劉英杰 楊平平 王燕 單位：齊魯工業(yè)大學(xué)