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《北京中醫藥雜志》2014年第五期

1材料

1.1中藥藥材:附子復方中藥藥材全部由北京中醫藥大學東方醫院藥學部中草藥房提供，其中附子為制附片。附子復方基本藥物組成:制附片(15g/30g/50g)，白芍(15g/20g/30g)，干姜(15g/20g/30g)，甘草(15g/20g/30g)等。

1.2試劑:氨水(分析純):500mL/瓶(西隴化工股份有限公司，批號1206183)，甲醇(分析純):500mL/瓶(北京化工廠:批號20120330)，去離子水(怡寶純凈水)，1.55L/瓶(廣州怡寶純凈水有限公司)，內標液(氫溴酸高烏甲素濃度200ng/mL):由廣州中醫藥大學中醫藥數理工程研究院提供成品。

1.3實驗儀器:旋渦混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號:XW-80A)，臺式離心機(珠海黑馬醫學儀器有限公司，型號:16K)，氮吹儀(天津市恒奧科技發展有限公司，型號:HSC-24B)。

2方法

2.1分組與編號入組受試者共56例，均為北京中醫藥大學東方醫院風濕科門診及病房患者，編號1～56，分別予《寒濕痹阻型痹證中醫癥狀評分表》測得癥狀積分，根據癥狀積分進行證候分級，分級標準為輕度:≤10分;中度:11～19分;重度:≥20分［4］。

2.2水煎劑制備與給藥方法根據各受試者輕、中、重度證候分級，分別給予含制附片15、30、50g的中藥復方，所有水煎劑均由北京中醫藥大學東方醫院制劑室統一代煎，每劑2袋，每袋150mL。受試者于晨起空腹服用第1袋水煎劑后開始計時，按照各自所選取的采血點進行采血，采血完畢后方可進服第2袋水煎劑。

2.3采血方法56例受試者每人隨機抽取2個采血點共計112個血樣，具體方法:受試者編號為1～56，依次每7例為一組共8組，各組每例受試者從14個采血點(5、10、15、30、45、60、75、90、120、180、240、360、720、1440min)中隨機選取2個數字，代表其2個采血時間點(同一組內如遇到2個相同隨機數字則舍去后1個)。各受試者服藥后于相應采血點取血2mL加入抗凝管，3000r/min離心5min后，取上清液血漿備用，平行2份樣品。

2.4樣品處理取200μL含藥受試者血漿和20μL內標液(氫溴酸高烏甲素200ng/mL)上樣，采用WatersHLB(30mgsorbent)柱固相萃取方法進行處理:(1)活化:萃取柱使用前先用甲醇和去離子水進行預處理;(2)渦旋和上樣:將含藥血漿內加入內標液，使用渦旋混合器均勻混合，混合液加入已活化萃取柱;(3)洗脫:先后用5%甲醇-水和5%氨水-甲醇洗脫，收集洗脫液作為樣品;(4)吹干:將洗脫液置于40℃水浴機內并以高純氮氣吹干;(5)密封和儲存:封口膠密封試管，－20℃環境保存樣品待測。

2.5樣品檢測每周將制備的臨床血漿樣品郵寄至課題合作單位廣州中醫藥大學中醫藥數理工程研究院，應用快速、靈敏特點的液質聯用儀檢測附子生物堿血藥濃度，檢測條件:(1)實驗儀器:WatersUPLCQuattroPremier液質聯用儀(美國沃特世科技有限公司)，TDL-5-A離心機(上海安亭科學儀器廠)，XK-96微量振蕩器(江堰市新康醫療器械有限公司);(2)色譜條件:色譜柱(WATERSACQUITYUPLCBEHC18)，流動相(CH3OH-0.2%HCOOH梯度洗脫);(3)質譜條件:離子源(電噴霧離子化源)，正離子檢測(電子噴霧電壓)，采用多反應檢測(MRM)。

3結果

將樣品200μL用流動相渦旋30s溶解，取5μL注入UPLC-MS/MS系統進行分析，采用內標法計算生物堿的血藥濃度。

3.16種生物堿隨行對照品色譜圖隨行對照品色譜圖見圖1。3.2群體藥動學病例的附子血藥濃度含量依據附子6種生物堿最低定量限0.1ng/mL，檢測結果發現受試者血漿中僅檢測到HA、BAC、BMA和BHA4種生物堿，另外2種生物堿AC、MA因濃度未達到檢出限而無法計算血藥濃度。4種生物堿血藥平均濃度及SD值見表1。根據4種生物堿的血藥平均濃度繪制血藥濃度-時間曲線，見圖2。由圖2所示，4種生物堿的血藥平均濃度達峰時間點均為75min;BMA在各時間點的血藥平均濃度均明顯高于其他3種生物堿，并且達峰平均濃度最高，其后依次為BHA、HA、BAC。圖24種生物堿血藥濃度－時間曲線

3.3藥動學參數經DAS2.1.1軟件擬合結果顯示，各生物堿最佳房室模型為二室模型，相關各藥代動力學參數見表2。

4討論

關于附子的毒性和用量，古籍記載歷代醫家用量不一，2005年版《中華人民共和國藥典》規定附子的用量為3～15g，因治療需要可用至15～30g。然而隨著“火神派”的崛起和發展，其對附子的用量多超常規劑量，少則50g多則200g，甚至可達500g以上［5］，臨床用量與權威規定相差甚遠。如何權衡附子毒性和療效之間的利弊關系一直存在著較大爭議，雖然近年來對中草藥有效性與安全性的研究不斷擴大和深入，但多因研究方法沒有考慮藥物治療與患者的生理、病理等多種因素的相關性而未取得突破性成果。群體藥代動力學(PPK)是符合中草藥自身特點的多成分藥動學研究方法［6］，其能夠定量地研究用藥群體中固定效應因素對血藥濃度和療效的影響，以及藥動學參數的個體間和個體內變異，有助于制定藥物的最佳個體化給藥方案，有助力臨床藥物監測以及控制用藥不良反應等［7］，從而能夠為中藥劑量方案的制訂與調整提供合理依據。

本研究選用附子炮制品制附片，并通過煎煮、配伍等方法減低其毒性，盡可能實現最大程度的用藥安全，分析PPK測取的數據結果可以看出:(1)服用含不同劑量附子的中藥復方水煎液后，臨床觀察無明顯不良反應發生，藥動學可測取的4種生物堿血藥濃度均低于中毒劑量，提示監測附子臨床用藥安全，具有指導性意義;(2)此前的動物實驗中給予比格犬口服附子單味藥材提取液，3個雙酯型和3個單酯型生物堿均能檢測，而本研究受試者服用附子復方水煎液后，只有3個單酯型和1個雙酯型(HA)生物堿達到檢測限，這可能是由于復方中藥煎煮和配伍等因素影響附子雙酯型生物堿的轉化和吸收，從而較大幅度降低了受試者血清中雙酯型生物堿的濃度，實現了“減毒”作用;(3)受試者血清中各生物堿在體內的藥代動力學過程符合二室模型，而對照動物實驗比格犬的藥代動力學模型的一室模型，兩者之間存在差異，并且附子在各受試者體內的代謝差異性較大，說明附子在人體內的代謝過程可能受到其他未知因素的影響，有待進一步深入研究。研習“有病則病當之”“有故無隕”的內涵，提示醫者在臨床應用附子時不必過分拘泥于常規，但并非鼓勵全部超常規應用，如何揚其宏效之長，避其峻毒之短是問題關鍵所在。筆者認為，在準確辨證論治的基礎上，把握煎煮方法和增效減毒配伍等方面因素以控制附子毒性［8］，同時依據病情變化靈活調配，可有效地減少或避免不良反應的發生，從而真正實現應用附子安全有效的最佳效果。

作者：侯秀娟李方凱錢荔李耿朱躍蘭單位：北京中醫藥大學東方醫院風濕科廣州中醫藥大學