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《臨床檢驗(yàn)雜志》2014年第六期

1材料與方法

1．1總RNA的提取和純化所有研究對象取清晨空腹靜脈血8mL，按Histopaque-1077淋巴細(xì)胞分離液(美國Sigma公司)說明書操作提取各樣本的外周血單個核細(xì)胞(PBMC)，實(shí)驗(yàn)在4h內(nèi)完成。用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)提取總RNA，用氯仿抽提、異丙醇沉淀RNA，70%乙醇洗滌2次，無RNase水溶解沉淀。取2μL樣本用Agilent2100Bioanalyzer芯片分析系統(tǒng)(美國AgilentTechnologies公司)定量檢測以評估總RNA，取28S/18S≥1．0、吸光度(A260/230nm)≥1．0、A260/280nm≥1．8的樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1．2芯片檢測以200ngRNA為模板，按照Illu-minaTotalPrepRNA擴(kuò)增試劑盒(美國Ambion公司)說明書操作將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并進(jìn)行cDNA合成及純化，由上海晶能公司完成。取1．5μgcDNA、10μL無RNase水(美國Ambion公司)及20μLGEX-HBY雜交液(Illumina芯片配套試劑，美國Illumina公司)于雜交管中混勻后，取30μL樣品加入HumanHT-12v4ExpressionBeadChip芯片(美國Illumina公司)中，在雜交槽中58℃雜交14～20h。最后在250mLE1BC溶液(Illumina芯片配套試劑，美國Illumina公司)55℃洗滌10min，室溫洗滌5min。用IlluminaBeadChipReader系統(tǒng)(美國Illumi-na公司)讀取及獲取圖像，然后對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理(IlluminaGenomeStudioSoftware，Illumina基因組工作室應(yīng)用程序，www．illumina．com．cn/soft-ware/genomestudio_software．a(chǎn)spx)，用R軟件(美國LucentTechnologies公司，www．r-project．org)進(jìn)行t檢驗(yàn)計算P值，以P＜0．05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異基因。同時以Illumina自行開發(fā)的算法IlluminaCustom(supportres．illumina．com/documents/myillumi-na/c94519f7-9348-4308-a32f-b66ff3959e99/genomestu-dio_gx_module_v1．0_ug_11319121_reva．pdf)計算出每個基因的表達(dá)倍數(shù)值(foldchange，F(xiàn)C)，F(xiàn)C≥2倍表示該基因表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)C＜2倍表示該基因表達(dá)下調(diào)，篩選出在PD-CI患者和體檢健康者外周血差異表達(dá)的基因。KEGGpathway富集度分析:將全部基因/轉(zhuǎn)錄本作為背景列表，差異基因/轉(zhuǎn)錄本列表作為從背景列表中篩選出來的候選列表，利用超幾何分布計算差異基因/轉(zhuǎn)錄本列表中的富集指數(shù)(foldenrichment，F(xiàn)E)，以P＜0．05為標(biāo)準(zhǔn)篩查前10名的KEGGpathway。實(shí)驗(yàn)由上海晶能公司完成。

1．3RT-PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果根據(jù)芯片數(shù)據(jù)結(jié)果，選取與疾病有關(guān)的差異表達(dá)基因并設(shè)計引物，引物由上海晶能公司設(shè)計，上海捷瑞公司合成。ABCA1(AF275948)上游引物序列:5''''-GACATCTTTCTGCGGGTGAT-3''''，下游引物序列:5''''-AGGACGTAGGGCAGGTACAG-3''''，產(chǎn)物片段大小為401bp;β-actin(BC002409)上游引物序列:5''''-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3''''，下游引物序列:5''''-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3''''，產(chǎn)物片段大小為564bp。以3例PD-CI患者和體檢健康者的總RNA為模板，用Fun-glynFTC-3000實(shí)時熒光定量PCR儀(加拿大Fung-lynBiotech公司)對芯片篩選結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，PCR總反應(yīng)體系為25μL，包括12．5μL2×QuantiFastSYBRGreenPCRmastermix(美國Qiagen公司)，10μmol/L上、下游引物各1．25μL，cDNA2．5μL，無RNAase水5．0μL。PCR循環(huán)參數(shù):95℃5min;95℃10s，59℃(ABCA1)/60℃(β-actin)30s，共40個循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。將與芯片結(jié)果一致的差異基因在其余35例漢族PD-CI患者與47例體檢健康者中進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，步驟同上。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果用2－△△Ct法計算。

1．4統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS18．0統(tǒng)計軟件進(jìn)行。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以x珋±s表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用成組設(shè)計資料的秩和檢驗(yàn)，以P＜0．05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2．1MMSE評估結(jié)果3例PD-CI患者和3例體檢健康者均具有初中以上文化程度，根據(jù)MMSE評估標(biāo)準(zhǔn)顯示，3例PD-CI患者都有中度的認(rèn)知功能障礙，體檢健康者無認(rèn)知障礙，見表1。

2．2差異基因聚類分析結(jié)果PD-CI組與健康對照組相比，基因芯片數(shù)據(jù)的聚類分析發(fā)現(xiàn)176個基因差異表達(dá)達(dá)到2倍以上，其中有68種基因上調(diào)，108種下調(diào)。部分差異基因結(jié)果如圖1所示。

2．3KEGGpathway富集度分析結(jié)果顯示，PD-CI組與健康對照組比較，10個具有統(tǒng)計學(xué)差異的KEGGpathway分別是膽堿能突觸(FE=5．569，P=0．005)、小細(xì)胞肺癌(FE=5．307，P=0．018)、癌癥的轉(zhuǎn)錄失調(diào)(FE=3．807，P=0．018)、GABA能突觸(FE=5．185，P=0．019)、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝(FE=50．125，P=0．020)、晝夜節(jié)律(FE=4．904，P=0．022)、趨化因子信號傳導(dǎo)通路(FE=3．342，P=0．028)、谷氨酸突觸(FE=4．064，P=0．035)、多巴胺突觸(FE=3．638，P=0．046)、精氨酸和脯氨酸代謝(FE=5．569，P=0．049)。其中多巴胺和膽堿能突觸涉及PD-CI的機(jī)制，KEGGpath-way的富集度分析結(jié)果顯示，二者的FE分別為3．638、5．569，PD-CI組與健康對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。

2．4實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果3例PD-CI和3例健康對照的2－△△Ct值分別為(0．125±0．028)和(1．969±0．381)，秩和檢驗(yàn)結(jié)果顯示，ABCA1基因表達(dá)下調(diào)(Z=－1．964，P=0．050)，與芯片結(jié)果基本一致，說明基因芯片結(jié)果可靠。而對35例PD-CI患者和47例健康對照者樣品RNA進(jìn)行實(shí)時熒光定量RT-PCR，其2－△△Ct值分別為(0．828±0．327)和(1．055±0．259)，結(jié)果顯示其目的基因表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=－2．742，P=0．006)。

3討論

本研究利用基因芯片篩查新疆地區(qū)漢族PD-CI患者與體檢健康者外周血表達(dá)差異基因。與體檢健康者相比，PD-CI患者外周血中表達(dá)差異2倍以上的基因共176條，其中表達(dá)上調(diào)68條，表達(dá)下調(diào)108條，這些差異基因主要涉及炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、防御反應(yīng)、創(chuàng)傷反應(yīng)、外部刺激反應(yīng)等功能。首先，本研究中多巴胺突觸通路異常(FE=3．638，P=0．046)與PD的病理基礎(chǔ)多巴胺代謝紊亂一致，中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺突觸的功能障礙不僅影響多巴胺的分泌和再攝取，而且額葉、紋狀體以及海馬旁回的多巴胺突觸缺陷也可能與記憶力、注意力減退及執(zhí)行功能受損有關(guān)。其次，在本研究中PD-CI患者的膽堿能突觸相關(guān)pathway的異常在KEGG富集分析中最為顯著(FE=5．569，P=0．005)。

病理學(xué)研究證實(shí)，α-突觸核蛋白以及tau蛋白在膽堿能突觸的異常聚集可誘導(dǎo)海馬旁回膽堿能細(xì)胞的凋亡。而我們的研究進(jìn)一步證實(shí)了PD-CI也存在膽堿能突觸的功能障礙，與Hilker等研究結(jié)果相吻合。相關(guān)研究也提示PD-CI患者皮質(zhì)下和皮質(zhì)區(qū)域內(nèi)膽堿受體的減少與認(rèn)知功能或抑郁癥狀的嚴(yán)重程度相關(guān)。其他信號通路研究方面，6-羥基多巴胺(6-OHDA)對黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元亦具有選擇性毒性作用，可以導(dǎo)致紋狀體幾乎所有的多巴胺丟失，以及與黑質(zhì)紋狀體多巴胺傳輸有關(guān)的谷氨酸能和GABA通路調(diào)節(jié)有關(guān)的基因表達(dá)改變。這些改變可能是紋狀體多巴胺水平降低的代償效應(yīng)，這與本研究GABA能突觸、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝異常相符(FE=5．185，P=0．019;FE=50．125，P=0．020)。而小細(xì)胞肺癌、癌癥的轉(zhuǎn)錄失調(diào)可能與多巴胺神經(jīng)元的丟失存在共同的凋亡路徑有關(guān)。基因芯片結(jié)果提示，176個基因表達(dá)差異達(dá)到2倍以上，其中ABCA1基因表達(dá)下調(diào)，其編碼的是一種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，通過在細(xì)胞膜上形成一種依賴ATP酶的通道介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的游離膽固醇和磷脂等成分的轉(zhuǎn)運(yùn)，對大腦中膽固醇的攝取與轉(zhuǎn)運(yùn)、apoE的脂化、神經(jīng)元膜結(jié)構(gòu)和功能、膽堿能突觸的數(shù)量和功能以及神經(jīng)炎性斑塊的發(fā)生、認(rèn)知功能的衰退等均產(chǎn)生重要影響。

ABCA1基因敲除小鼠與正常對照鼠相比，其學(xué)習(xí)能力和記憶水平明顯下降，可能與ABCA1表達(dá)下降導(dǎo)致β-淀粉樣蛋白寡聚物異常沉積在海馬有關(guān)。本研究中RT-PCR結(jié)果提示，35例PD-CI患者差異基因ABCA1的表達(dá)低于47例健康對照者(Z=－2．742，P=0．006)。結(jié)合膽堿能突觸異常的KEGG富集分析，提示PD-CI可影響血液中ABCA1基因的表達(dá)，而該基因的表達(dá)下降可能與PD患者認(rèn)知功能的損害有關(guān)。這也與Pahnke等的研究結(jié)果相符。然而本研究僅僅從ABCA1mRNA表達(dá)水平揭示其表達(dá)異?？赡苁荘D-CI的一個潛在的生物標(biāo)志物，該基因引起PD-CI的具體分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

作者：羅琴夏歡楊新玲單位：新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院干部病房科