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《畜牧獸醫學報》2014年第八期

1方法

1．1Mhp菌液培養Mhp168株和Mhp168L株接種于KM2培養基中。以1∶10復壯，待菌液培養至對數生長期時備用。

1．2SJPL細胞培養SJPL細胞培養于含10％小牛血清、100U•mL－1青霉素和100U•mL－1鏈霉的DMEM培養液，待細胞生長達90％時，胰蛋白酶消化，稀釋至1．5×105•mL－1，以100μL•孔－1接種于96孔培養板，在37℃、5％CO2的培養箱中培養24h。

1．3Mhp感染細胞取新鮮培養的處于對數生長期的Mhp168和Mhp168L菌液以12000r•min－1，離心20min，菌體沉淀用PBS洗滌1次，用DMEM培養基（無血清）重懸。96孔板中的SJ－PL細胞棄去上清，然后用PBS洗滌3次。DMEM（無血清）培養基重懸的Mhp接種于鋪有細胞的孔中，對照組接種等體積的DMEM（無血清）培養基，37℃、5％CO2的培養箱中培養。

1．4感染時間、劑量的篩選在感染12、24、36、48h時取細胞上清，用NO試劑盒測定NO濃度；取細胞用MTT法測定細胞活力，找出差異顯著的感染時間點；用感染劑量為1×106、3×106、5×106和7×106CCU的Mhp感染細胞，利用上一步確定的感染時間，檢測細胞活力及NO。

1．5H2O2檢測取感染好的細胞，先將細胞收集到離心管中，棄上清，加入過氧化氫檢測裂解液，充分勻漿以裂解細胞，4℃，12000r•min－1，5min，取上清，按照H2O2試劑盒測定方法檢測。

1．6免疫熒光法檢測PBS洗滌未黏附的Mhp3～5次，每次5min；無水乙醇4℃固定30min。PBS洗滌5次，1％BSA37℃封閉30min，PBS洗滌3～5次，與MhpP46單抗（1∶1000稀釋）37℃孵育1．5h，PBS洗滌3～5次，與FITC－羊抗小鼠IgG（1∶200稀釋）37℃孵育1h，PBS洗滌3～5次，熒光顯微鏡觀察，拍照。

1．7DAPI染色免疫熒光拍照后，將96孔板用PBS洗滌5次，每次5min，加入DAPI染色5min，PBS洗滌3次，每次5min，熒光顯微鏡觀察，拍照。

1．8統計分析測定結果使用SPSS15．0軟件進行One－wayANOVA分析。

2結果

2．1感染時間和感染劑量的篩選

2．1．1不同感染時間后細胞上清NO濃度和細胞活力從圖1可以看出，在36h時，Mhp168和Mhp168L感染細胞后，細胞活力相同，但Mhp168引起的NO濃度顯著（P＜0．05）高于Mhp168L。

2．1．2不同感染劑量36h后細胞上清NO濃度從圖2可以看出，不同感染體積，細胞活力無差異，但在感染量為5×106CCU時，其NO濃度顯著性高于其它感染體積（P＜0．01），并且Mhp168顯著性高于Mhp168L（P＜0．05）。

2．25×106CCUMhp感染細胞36h后測定的H2O2濃度結果顯示，在感染36h后，Mhp168和Mhp168L感染SJPL細胞產生的H2O2濃度極顯著（P＜0．01）高于對照，而Mhp168感染細胞產生的H2O2也顯著（P＜0．05）高于Mhp168L。

2．3Mhp5×106CCU感染細胞36h后IFA檢測Mhp168和Mhp168L對SJPL細胞影響的間接免疫熒光結果見圖4，與對照相比，Mhp168L在SJ－PL上的黏附量高于Mhp168。

2．4Mhp5×106CCU感染細胞36h后DAPI染色對感染細胞進行DAPI染色如圖5。與對照相比，Mhp168感染后，細胞受到損傷，細胞膜破損，染色質向外周聚集，呈絮狀，細胞體積明顯腫脹變大，而Mhp168L感染的細胞，細胞體積也增大，Mhp168L對細胞損傷較輕，其細胞周邊也有較少的染色質聚集。

3討論

Mhp168株是野毒分離株，具有一定的感染性，為江蘇省農業科學院獸醫研究所早期分離鑒定。168株經多年的連續傳代培育為適應無細胞培養基（KM2）的人工致弱毒株，即168L株，已用該菌株研發成功具有良好的安全性和免疫保護效力的弱毒活疫苗，可有效預防豬氣喘病的發生。豬肺炎支原體致病株168株和弱毒株168L株是來源于同一母本株的不同毒力株，全基因組分析顯示基因組差異較小，選這兩株同一來源不同毒力的Mhp感染細胞，并對其進行氧化損傷分析，可為該病的致病機制研究提供非常良好的理論基礎。這在國內外屬于首次報道。豬肺炎支原體可以黏附于豬呼吸道上皮細胞、豬肺泡上皮、豬腎細胞PK15、微型豬肺纖維原細胞WWPL和人肺纖維原細胞MRC－5。車巧林等用豬肺炎支原體XLW－1黏附豬腎細胞PK－15從而建立豬肺炎支原體黏附宿主細胞間接免疫熒光檢測的方法，張旭等也利用間接免疫熒光法檢測了不同毒力支原體分別對豬腎細胞PK－15的黏附情況。眾多的文獻研究豬肺炎支原體感染豬氣管上皮細胞，而利用Mhp強弱毒株體外感染靶細胞后的氧化損傷差異分析卻未見報道。

作者希望對強弱毒株感染細胞的氧化損傷差異進行分析，從Mhp感染細胞后的反應中獲得宿主的差異表達方面，通過分子病理學，分子免疫學，轉錄組學、蛋白組學、代謝組學等多方面來共同進行研究，只有這樣才能更加全面準確地解釋和揭示豬肺炎支原體的致病機制，才能對豬支原體肺炎的防治和診斷起到積極的作用。

作者：李彥偉劉茂軍劉蓓蓓武昱孜倪博白方方紀燕張映 邵國青單位：江蘇省農業科學院獸醫研究所／農業部獸用生物制品工程技術重點實驗室／國家獸用生物制品工程技術研究中心山西農業大學南京農業大學動物醫學院