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《畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)》2014年第八期

1材料和方法

1.1抑菌圈試驗(yàn)杯蝶法杯蝶法一般采用雙層瓊脂平板為指示菌平板，底層加入15mL2%的融化素瓊脂。待底層冷卻后，放入數(shù)個外徑為6mm的牛津杯，取1mL一定濃度指示菌菌懸液加入到15mL冷卻至45℃左右的瓊脂濃度為1%的培養(yǎng)基中，迅速混勻，傾倒到素瓊脂之上，冷卻后用無菌鑷子將牛津杯取出，即形成若干孔洞，分別向內(nèi)注入200μL發(fā)酵上清液，37℃溫育24h，觀察孔洞周圍抑菌圈大小，并且用游標(biāo)卡尺測定透明圈直徑。

1.2混合培養(yǎng)菌中L.acidophilus的胞外乳酸含量的測定將待測菌液去除菌體保留上清液，采用高效液相色譜儀檢測其乳酸含量。

1.3混合培養(yǎng)菌中L.acidophilus的乳酸脫氫酶活力的測定取上清液采用WFH-201BJ分光光度計(jì)測定，參數(shù)設(shè)置依據(jù)試劑盒說明書。

1.4混合培養(yǎng)菌中L.acidophilus的glyA和ldh基因表達(dá)的檢測根據(jù)L.acidophilus在NCBI的GenBank中登錄的L.acidophilus序列(NC_006814)，設(shè)計(jì)引物，通過real-timePCR方法檢測glyA基因(5''''-GAAGATTTACAGCCACAG-3''''/5''''-TGCCACCAGATACTACAC-3'''')和ldh(5''''-GTAGCCTTTTCCATTTGC-3''''/5''''-TCGCTTGGTCCACTGTTC-3'''')。

2結(jié)果

2.1L.acidophilus與S.aureus混合培養(yǎng)的生長曲線變化在生長到對數(shù)生長期的L.acidophilus培養(yǎng)物中加入1%的S.aureus后共同培養(yǎng)24h時，L.aci-dophilus菌數(shù)達(dá)最大值；而加入10%S.aureus時，L.acidophilus菌數(shù)變化與L.acidophilus對照組不顯著。表明加入1%S.aureus對L.acidophilus菌數(shù)的增殖促進(jìn)作用明顯。在整個培養(yǎng)過程中，未處理組與1%混合培養(yǎng)組變化不大，表明加入1%S.aureus對L.acidophilus的增殖無影響，而在加入10%接種量時，L.acidophilus菌數(shù)有較明顯下降，并且對其增長曲線影響較大。

2.2L.acidophilus與S.aureus混合培養(yǎng)上清液抑菌圈直徑變化隨著培養(yǎng)時間增加，3個實(shí)驗(yàn)組抑菌圈直徑均逐漸加大，培養(yǎng)到12h時，加入1%S.aureus組抑菌圈直徑增加最明顯，之后，隨著培養(yǎng)時間的增加抑菌圈直徑變化不大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入1%S.aureus后的L.acidophilus在培養(yǎng)到12h時，抑菌作用最顯著。

2.3L.acidophilus與S.aureus混合培養(yǎng)上清液中乳酸含量的變化生長至對數(shù)期的L.acidophilus加入不同接種量的S.aureus再培養(yǎng)的過程中，L.aci-dophilus產(chǎn)乳酸隨混合菌液培養(yǎng)時間增長含量增加，但由培養(yǎng)時間6h～12h時增加明顯，在12h～36h過程中增加較為緩慢(圖3)，表明在12h時是L.aci-dophilus代謝最旺盛時期。

2.4L.acidophilus與S.aureus混合培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶活力變化L.acidophilus與S.aureus混合菌液從6h～12h培養(yǎng)過程中乳酸脫氫酶活力顯著增加，但從12h～24h過程中活力平穩(wěn)并且逐漸下降，從24h～36h過程中，活力下降明顯。S.aureus接種量為1%和10%的兩種不同菌液變化趨勢相同，但接種量10%比接種量為1%的乳酸脫氫酶活力較小(圖4)。表明S.aureus接種于L.acidophilus量不同，其對L.acidophilus乳酸脫氫酶活力的影響也不同，但總體變化趨勢一致。

2.5混合培養(yǎng)中L.acidophilus的glyA和ldh基因表達(dá)的檢測生長到對數(shù)生長期的L.acidophilus加入1%S.aureus共培養(yǎng)12h時，L.acidophilusglya基因表達(dá)量達(dá)到峰值，隨后下降明顯，至24h達(dá)最低值。glyA基因在未處理組及接種量為10%的試驗(yàn)組中表達(dá)量不明顯，而在接種1%S.aureus時共培養(yǎng)12h時卻明顯增加，表明接種量1%的S.aureus對L.acidophilusglyA基因的表達(dá)量有明顯的促進(jìn)作用；L.acidophilusldh基因表達(dá)量達(dá)到峰值，而加入10%S.aureus共培養(yǎng)時，L.acidophilusldh基因表達(dá)量變化不明顯(圖5)。試驗(yàn)表明，L.acidophilus在接種1%S.aureus培養(yǎng)12h，ldh基因表達(dá)量增加最多，表明接種1%S.aureus時對L.acidophilusldh基因表達(dá)量影響最大。

3討論

L.acidophilus是一種常見的益生菌[5]，近幾年對其在食品、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)中的影響研究較多，因L.acidophilus對耐藥性的S.aureus具有較好的抑菌效果而受到重視，尤其是飼喂后對動物的免疫力的提高作用顯著。其代謝產(chǎn)生的乳酸，是一種重要抑菌因子，可透化細(xì)菌外膜，從而抑制或殺死金黃色葡萄球菌。但有關(guān)L.acidophilus添加不同比例的S.au-reus混合培養(yǎng)后其生理變化，尤其是有關(guān)產(chǎn)抗菌肽特性變化的研究較少。L.acidophilus雖有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)分解能力,但自身產(chǎn)酸速率較慢，本實(shí)驗(yàn)加入不同接種量的S.aureus對其產(chǎn)乳酸以及乳酸脫氫酶活力的增加都有較強(qiáng)的促進(jìn)作用。ldh基因和glyA基因都是L.acidophilus代謝調(diào)控的關(guān)鍵酶基因：ldh基因編碼的乳酸脫氫酶能利用丙酮酸生成乳酸；蘇氨酸在glyA基因編碼的蘇氨酸醛縮酶的催化作用下能夠生成乙醛。本實(shí)驗(yàn)中L.acidophilusglyA基因及l(fā)dh基因可能對加入一定量的S.aureus較為敏感，當(dāng)加入S.aureus達(dá)到一定量時除了能夠促進(jìn)其抗菌肽的產(chǎn)出量外，對產(chǎn)酸及其它生理特性都有很大的促進(jìn)作用。綜合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入1%的S.aureus和L.acidophilus混合培養(yǎng)12h時L.aci-dophilus的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)增加最顯著，此時，L.acidophilus產(chǎn)抗菌肽活性最強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)對L.aci-dophilus產(chǎn)抗菌肽的抗菌機(jī)理的研究，具有一定的理論指導(dǎo)意義。

作者：劉營于微孫吉吉張明輝高學(xué)軍敖金霞單位：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物功能基因重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物技術(shù)研究中心乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室