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摘要:生物活性肽在細胞生理以及機體代謝方面具有重要的調節作用。近些年來，研究者們在兩棲動物體的皮膚分泌物中發現大量的生物活性肽。文中在查閱大量的相關文獻基礎上，對兩棲動物皮膚中分泌的生物活性肽的種類、來源、作用機理及相關的生理作用等進行了綜述，以期為擴大生物活性肽的研究與應用提供參考。

關鍵詞:兩棲動物;生物活性肽;生理功能;藥理活性

生物活性肽是指25個天然氨基酸以不同方式排列和組成，分子量＜6ku，對生物機體的生命活動發揮裨益作用或具有生理功能的多肽類化合物的總稱［1］。活性肽在細胞生理及機體代謝功能的調節上發揮著重要作用，且這些調節作用幾乎參與人體所有的生理活動，如人體的神經系統、循環系統、消化系統以及內分泌系統等多個生命活動［2］。不僅如此，其中許多生物活性肽還存在有原蛋白或其組成氨基酸所不具備的獨特的生理功能［3］。因此活性肽有著廣泛的藥物研發潛力，已經在世界范圍內成為一個研究熱點。兩棲動物是一類在自然界中存在的動物群體，與其他動物相比較兩棲動物的皮膚結構特點沒有鱗片或毛發的保護，且皮膚內有豐富的腺體(主要包括黏液腺與顆粒腺)分布，而腺體分泌物是兩棲動物生物化學物質的主要來源［4］，包括生物活性多肽類、生物堿、生物胺以及甾類化合物等。其中種類最多的是活性多肽和生物胺類，并且兩棲動物皮膚活性多肽的種類較多于哺乳動物皮膚分泌的活性種類［4-5］。因此，對從兩棲動物皮膚中提取分離出的活性多肽物質的探索已經成為國內外學者的研究熱點。目前已經從兩棲動物皮膚提取物中分離出的生物活性肽包括抗菌肽、抗氧化肽、緩激肽等。為此，本文對兩棲動物皮膚生物活性肽的種類以及生物功能加以說明，為擴大生物活性肽的研究領域提供理論參考。

1活性肽的種類及其生理功能

1．1抗菌肽往往把由生物體產生的具有一定的抗微生物、抗細菌與抗癌細胞等活性的小多肽類物質稱為抗菌肽［6］。到目前為止已有上千種的抗菌肽從兩棲動物皮膚分泌物中被發現，有資料顯示，10余種結構與功能不同的抗菌多肽從單個大蹼鈴蟾皮膚分泌物中被提取出來，不僅如此，在種類不同的兩棲動物皮膚中貯存的抗菌肽的種類也不相同［7-8］，按照抗菌肽序列的相似性，可將兩棲抗菌肽分為gae-gurins，brevinin－1，brevi-in－2，ranalexin，ranatuerin－1，ranatuerin－2，esculentin－1，esculentin－2，alustrin，japonicin－1，japonicin－2，nigrocin－2，rugosins，tem-porin等不同的抗菌肽家族［9］。除此之外，通常都是根據兩棲動物皮膚分泌的抗菌肽結構的不同將其分成兩大類:含有α－螺旋結構的線性抗菌肽與具有分子內二硫鍵的環狀抗菌肽。1．1．1線性抗菌肽線性抗菌肽的殺菌作用很強。該種肽不存在二硫鍵，其作用機制是通過靜電相互吸引的作用使具有兩親性質的α－螺旋肽上所帶的正電荷與微生物細胞膜的磷脂雙分子層所帶的負電荷結合，從而使抗菌肽進入微生物細胞的質膜內，因此磷脂雙分子層的原有結構被破壞，使內溶物流出，最終致使微生物死亡而達到殺菌的目的。Bombinins是第1個被發現來源于兩棲動物的典型的α－螺旋抗菌肽。除此之外，tem-porins，dermaseptins，Maximin等也都是α－螺旋［10］。研究表明，這類抗菌肽在抑制與殺死細菌、真菌和原蟲等方面都發揮著不可忽視的作用，但對人類的細胞無影響［11-13］。

1．1．2環狀抗菌肽環狀抗菌肽是因為其C－末端存在兩個半胱氨酸殘基，從而形成一個分子內二硫鍵的結構。此種抗菌肽與α－螺旋肽的作用機理相類似，幾乎都是破壞微生物的膜結構，使內溶物流出，從而導致微生物的死亡［14］。絕大多數的兩棲動物的抗菌肽都屬于此結構類型，如bre-vinins，esculentins，japonicin等家族都是含有二硫鍵的環形肽［15］。除此之外，在日本林蛙Ranaja-ponica中提取到的Japonicin-2與印度虎紋蛙Ranatigerina中提取到的Tigerinin1抗菌肽分子內分別含有一個8肽環與一個9肽環［9-16］。

1．2抗氧化肽兩棲動物是由水中過渡到陸地生活的代表性生物，鑒于其皮膚是裸露在外部的特殊結構，對于其是如何抵御來自大自然強烈的紫外線照射的氧化威脅，又是如何免受空氣中的自由基的傷害就成為了眾多學者想要探究的課題。經研究發現，抗氧化肽具有清除機體內自由基，維持細胞器正常功能，使機體保持穩態的重要能力［17］。抗氧化肽的作用機制是以“第三套抗氧化系統”［18］來命名的一種新的防御機制，而對于此新的防御機制具體是如何進行的還未有明確的報道，依然有待于探究。目前抗氧化肽的種類已經在多種兩棲動物皮膚中被提取分離得到。有研究者已從滇蛙(R．pleuraden)的皮膚分泌物中提取分離到了11個來自不同家族的抗氧化多肽，并且對其一級結構進行分析，結果發現這些抗氧化多肽存在高度同源的信號肽區域，但是也同時發現這些成熟肽區域又存在很大的差異性，所以也給出了這些抗氧化多肽可能來自于共同祖先的結論［18］。除此之外，在大綠蛙與林蛙等的皮膚中也發現了多種來自不同家族的抗氧化多肽［19-20］，而且也證實了這些抗氧化多肽能在很短的時間內清除大部分自由基。在兩棲動物皮膚分泌物中發現抗氧化多肽的研究成果為其在醫療事業領域的應用開辟了新途徑。

1．3緩激肽緩激肽主要是激肽釋放酶－緩激肽系統中最終降解為含有C—CO2H殘基的一類多肽［21］，且緩激肽在體內的半衰期很短，一般＜0．5min［16］。緩激肽是通過β1和β2兩種不同的受體發揮其生理作用，其中動物體內β2受體分布范圍比較廣泛，而且緩激肽大多情況下是通過β2受體對心臟進行保護作用的［22］。研究者通過試驗發現，去除小鼠的緩激肽的β2受體后，引起了小鼠心力衰竭及擴張性心臟病［23］。雖然β1受體的含量少，對緩激肽無應答作用，但卻對缺失第9個氨基酸殘基的緩激肽或另一些des－Arg相似物發揮應答作用。如緩激肽可以通過β1受體對大鼠的離體回腸縱紋平滑肌起收縮作用［24］。有報道結果顯示，目前已經從多種兩棲動物中發現了緩激肽的存在。如在大蹼鈴蟾皮膚中發現了由19個氨基酸殘基組成的新型緩激肽Bom-binaininM［25-26］。在蛙屬(Rana)與鈴蟾屬(Bom-bina)皮膚中分離得到了10多種緩激肽，且研究證實這些緩激肽在擴充血管，調節血壓濃度以及抗心肌缺血等方面都發揮了不可忽視的作用［27-28］。除此之外，從中國林蛙皮膚中也分離得到了緩激肽［29］。與哺乳動物相比，兩棲動物中的緩激肽的生物合成途徑與其前體物質生物合成酶的加工過程有待進一步探索。

1．4促胰島素釋放肽促胰島素釋放肽是可調節機體內胰島素分泌的一類活性肽，具有降低血糖的作用。近幾年來已經分離出多種來源不同的促胰島素釋放肽，并且目前在兩棲動物中也發現并分離得到了多種不同結構的促胰島素釋放肽。在棕點湍蛙皮膚中提取分離得到了amolopin－1促膜島素釋放肽，從云南小狹口蛙皮膚中分離得到了促胰島素釋放肽。另外，從多彩鈴蟾(Bombinavariegate)，無指盤臭蛙(Odorranagraham)，豹蛙(R．pipiens)等蛙類中也發現了多種促胰島素釋放活性肽［30-34］。此外，研究發現，有些兩棲動物的抗菌肽不僅具有抗菌性，還具有促胰島素釋放活性。如在樹蛙皮膚中得到的抗菌肽Plasticin－L1，除了具有抗菌活性外，還具有促進胰島素釋放的活性［35］。

1．5神經肽目前已經在兩棲皮膚分泌物中提取得到的神經肽有蛙皮素、雨蛙肽、皮啡肽、速激肽、Deltorphin肽、色胺酰肽以及雜類神經肽等，這些神經肽在兩棲動物的機體內發揮著重要的生理作用［36-39］。

1．6香偶素1995年，從雄性蠑螈體內分離得到第一個屬于脊椎動物的香偶素，并命名為sodefrin，研究發現，此種活性肽可吸引雌性動物并具有特異性。在兩棲動物繁殖季節里，香偶素在其皮膚中的含量可達到1%，而在非繁殖季節則會下降到＜0．1%［16，40］。

1．7其他活性肽目前研究發現澳洲Litoria與Uperoleia的蛙類皮膚分泌物是兩棲動物抗癌肽的主要來源?？拱╇闹饕搔粒菪Y構的Aurein家族與16個氨基酸殘基組成的C端酰胺化的Citropin家族組成。Aurein和Citropin都是具有較強抗癌活性的活性肽［10］。從Bombinabombina的皮膚分泌物中得到了一類多肽化合物，命名為Bombesin，此后在其他蛙種中提取到了結構和功能與Bombesin相似的多肽ranatensin，litorin與phyllolitorin。Bombesin作用于平滑肌，致使血管緊縮，抑制尿液分泌，而且在治療神經系統疾病方面具有良好的效果［41-42］。發現的兩棲動物皮膚分泌的活性肽除了上述的種類之外，還有其他研究者提取獲得了胰蛋白酶抑制劑［43］、免疫活性肽［44］、降壓肽［45］、爪蟾肽、抗精子活性的BV8肽［46］等生物活性物質，兩棲動物皮膚分泌物的生物活性肽種類繁多，結構功能各異，這些生物活性肽對自然界生物的進化以及醫療事業的發展都起到了非常重要的促進作用。

2活性肽的提取與分離純化方法

2．1活性肽粗提物的提取方法

2．1．1直接提取法在早期對兩棲動物皮膚活性肽的浸提最常用的兩種有機溶劑是乙醇與甲醇兩種。此種方法的步驟一般都是把活體動物處死之后迅速剝皮并剪碎勻漿，再利用有機溶劑浸提，獲得的溶液經過離心取上清進行冷凍干燥之后的物質為活性肽的粗提物。徐興軍等［47］運用酸化乙醇從中國林蛙與中華蟾蜍的皮膚中浸提出抗菌肽的粗提物，通過抑菌試驗證明，兩種皮膚的抗菌肽對枯草桿菌均有很強的抑制作用，并且發現中華蟾蜍的皮膚粗提物對枯草桿菌的抑制作用優于中國林蛙的。

2．1．2誘導提取法直接提取的方法操作雖然簡單，但是此法會導致兩棲動物的死亡且產物得率較低，目前，采用溫和誘導法(包括電刺激、乙醚刺激或注射去甲腎上腺激素等)刺激兩棲動物皮膚顆粒腺體的方式獲得其皮膚分泌物。這種方法不需要處死兩棲動物，可重復收集活性肽，主要操作過程是采用溫和誘導方法刺激兩棲動物使其皮膚產生大量分泌物，然后用去離子水或者含有低濃度的三氟乙酸的水溶液沖洗動物體皮膚，收集分泌物，再經過離心獲得上清液，冷凍干燥后的物質為活性肽的粗提物。楊紅玲等［48］應用乙醚刺激法從鋤足蟾蜍科小角蟾的皮膚毒素中提取出了含有抗微生物能力的活性肽Megin1和Megin2。徐佳佳［49］利用電刺激方法從東北林蛙皮膚上獲得了抗菌肽。

2．2活性肽的分離純化方法將兩棲動物皮膚活性肽的粗提物進行分離純化的方法主要有凝膠過濾色譜、離子交換色譜與高效液相色譜3種方法，雖然用單一的分離方法可以使不同的活性肽分離開，但是通常采用的是幾種方法組合使用，這樣可以使不同的活性肽達到更好的分離效果。

2．2．1凝膠過濾色譜凝膠過濾色譜是利用分子篩原理將不同分子質量的活性肽進行分離的一種方法。此法操作簡單并且蛋白質不易變性。王利峰等［50］利用SephadexG－50和SephadexG－25兩步凝膠過濾步驟將大鯢皮膚分泌物中的抗菌肽進行了分離。

2．2．2離子交換色譜根據待分離物質的帶電性質及帶電量的差異將不同物質進行分離的一種色譜方法。大部分的活性肽都是陽離子，因此可以運用此方法對兩棲動物皮膚分泌的活性肽進行分離。Lai等［12］利用DEAE－SephadexA－50離子交換色譜與SephadexG－50凝膠過濾色譜相結合，在中國紅蟾蜍皮膚分泌物中分離出了5種抗菌肽。

2．2．3高效液相色譜目前，越來越多的研究者采用高效液相色譜法對兩棲動物皮膚的活性肽進行分離，此法比較迅速高效。范譯文［51］利用制備型高效液相色譜與分析型高效液相色譜結合方法從野生黑斑蛙的皮膚中分離出了抗菌肽。馮浩等［30］利用SephadexG－50凝膠過濾色譜與反相高效液相色譜相結合的方法從棕點湍蛙皮膚分泌物中分離出了促胰島素釋放肽。

3問題與展望

雖然目前已經從兩棲動物皮膚分泌物中鑒定出了多種活性肽物質，并且部分的生物活性也已經知曉，但是其在兩棲動物體內相關的生物學功能與作用機理還有待進一步探究。而且由于某些特殊的生物活性物質在兩棲動物體內的分泌量少，因此在今后的研究中可以考慮尋找更多的生物替代資源或者應用人工合成技術擴大需求量。

作者：常雷；陳寧寧；岑欣桉；衛功慶 單位：吉林農業大學動物科學技術學院