本站小編為你精心準備了人原代白血病細胞的體外研究參考范文，愿這些范文能點燃您思維的火花，激發您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

《藥物評價研究雜志》2015年第三期

1方法

1.1形態學觀察原代白血病細胞，調整密度為2×105/mL，按每孔2mL接種于6孔板中。實驗組加入終質量濃度分別為0.2、0.5、0.8mg/mL的苦參堿藥液，陰性對照組加入等體積1640培養液，作用24、48h后倒置光學顯微鏡下觀察白血病細胞形態學改變。

1.2苦參堿對原代白血病細胞作用濃度–時間曲線的測定原代白血病細胞調整密度為1.5×105/mL，按每孔1mL接種于24孔板中。實驗組加入苦參堿藥液，終質量濃度分別為0.2、0.5、0.8mg/mL，陰性對照組加入等體積1640培養液，每組設6個平行孔。細胞于37℃、飽和濕度、5%CO2培養箱中常規培養。每天各實驗組取出1孔，臺盼藍染色計數活細胞，連續計數6次，繪制苦參堿對白血病細胞的作用濃度和時間曲線。每個實驗至少重復3次。

1.3CCK-8增殖實驗原代白血病細胞調整密度為2×105/mL，按每孔200μL接種于96孔板中。實驗組加苦參堿藥液，終質量濃度分別為0.2、0.5、0.8mg/mL，另設不加藥組為對照組，無細胞單加藥組為空白組，每組設3個平行孔。細胞分別培養24、48h后，CCK-8法檢測苦參堿對細胞的影響。細胞增殖活性計算公式：[（實驗組A450－空白組A450）/（對照組A450－空白組A450）]×100%。每個實驗至少重復3次。

1.4AnnexinV-FITC/PI雙標記法檢測細胞凋亡原代白血病細胞調整密度為2×105/mL，按每孔3mL接種于6孔板中。實驗組分別加入0.2、0.5、0.8mg/mL苦參堿處理。24h后，收集細胞以預冷0.01mol/LPBS洗滌2次，以100μL1×Annexin-bindingbuffer重懸細胞，調整細胞數目在1×106個/mL，實驗組和對照組細胞內依次加入5μLAnnexin-V和1μLPI工作液；另設Annexin-V和PI單染對照，分別加入5μLAnnexin-V或1μLPI工作液；避光室溫孵育15min，各管內加入400μL1×Annexin-bindingbuffer，混勻避光至于冰上。以FITC標記的Annexin-V和碘化丙啶（propidiumiodide，PI）染色流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。每個實驗至少重復3次。

1.5細胞周期分析原代白血病細胞調整密度為2×105/mL，按每孔5mL接種于6孔板中。實驗組分別加入終質量濃度0.2、0.5、0.8mg/mL苦參堿處理。48h后，收集細胞以預冷0.01mol/LPBS洗滌2次，以500μL冰70%乙醇固定細胞，−20℃過夜。后離心棄上清，以預冷0.01mol/LPBS洗滌2次，實驗組和對照組細胞內依次加入100μLTritonX-100（0.1%）破膜，5min。后離心棄上清，以預冷0.01mol/LPBS洗滌2次，加入終質量濃度0.2mg/mLRNeA，50μg/mLPI，避光室溫孵育30min，流式細胞儀檢測各組細胞周期情況。每個實驗至少重復3次。1.3統計學分析數據用采用SPSS17.0統計軟件處理，計量資料以x±s表示。組間比較采用單因素方差分析，并進行組間兩兩比較。

2結果

2.1形態學觀察原代白血病細胞經苦參堿處理前后，細胞形態發生明顯變化。見圖1，對照組經24h培養后，細胞數量略有增加，形態呈圓形透亮狀，折光性減弱，胞質中出現細顆粒狀物質；而經苦參堿處理24h，細胞數量雖有增加，但胞體脹大，內有空泡，核內染色質固縮，可見死亡細胞及碎片。培養48h后，對照組細胞略有增加，細胞形態脹大，可見些許死亡細胞及碎片；苦參堿處理組細胞數量減少，核內染色質固縮，細胞破裂降解，細胞開始大量死亡。

2.2苦參堿抑制原代白血病細胞的增殖活性不同濃度苦參堿對原代白血病細胞的生長均顯示抑制作用，呈藥物濃度相關性。由圖2A生長曲線可見，隨著苦參堿處理濃度的增加，細胞的增值速度減慢?？鄥A0.2mg/mL組48h細胞計數為（15.33±1.04）×104，苦參堿0.5mg/mL組為（9±0.87）×104，對照組為（17.83±1.26）×104。隨著苦參堿作用時間的延長，處理組細胞數減少更加明顯。5d時，苦參堿0.2、0.5、0.8mg/mL組細胞計數依次為（10±1）×104、（6.67±1.15）×104、（5.67±0.58）×104。隨著苦參堿處理濃度的增加，抑制作用逐漸增強，見圖2B。24h苦參堿處理組細胞活性依次為（66.10±11.02）%、（45.02±18.21）%、（27.04±7.89）%。其中0.5、0.8mg/mL與對照組差異顯著（P＜0.01）。而且0.2mg/mL與0.8mg/mL之間也存在顯著差異（P＜0.05）。苦參堿處理時間延長后，48h苦參堿0.2mg/mL組細胞活性為（79.68±6.59）%，抑制作用有所減弱；苦參堿0.8mg/mL組細胞活性為（25.88±21.01）%，抑制作用略有增加，但是差異無顯著性。苦參堿對原代白血病細胞的抑制作用呈劑量相關性，其中苦參堿0.5mg/mL在24、48h均呈現半數抑制。

2.3苦參堿誘導原代白血病細胞凋亡苦參堿對原代白血病細胞誘導凋亡作用具有劑量相關性，見圖3?？鄥A作用24h，對照組的細胞凋亡率約為8.71%，隨著苦參堿加藥濃度的增加，細胞凋亡率分別為13.37%、40.62%、63.21%，其中早期凋亡率分別為11.8%、37.6%、54.7%。2.4苦參堿阻滯原代白血病細胞于G0/G1→S期苦參堿處理48h后，原代白血病細胞的周期發生改變。其中G0/G1期細胞逐漸增多，S和G2期細胞比例顯著降低，見圖4。G0/G1期細胞逐漸增多，其中對照組為74.7%，苦參堿0.5mg/mL組為88.06%，苦參堿0.8mg/mL組為90.4%。S和G2期細胞比例顯著降低，S期對照組為8.22%，苦參堿0.5mg/mL組為4.42%。G2期對照組為17.08%，苦參堿0.2、0.5、0.8mg/mL組依次為16.75%，7.52%，2.48%。顯示細胞周期阻滯于G0/G1→S期。

3討論

白血病是一種造血系統惡性腫瘤，在我國青少年中發病率較高，其高度增生和惡性侵襲的生物學特性使其臨床防治始終是一個難點。白血病的常規療法主要是放療和化療，但是由于缺乏選擇特異性，往往對正常組織、器官（特別是骨髓和消化道）造成功能性或器質性損傷。因此，尋找新的治療方法和有效的抗癌藥物具有重要意義。中草藥以其副作用小，價廉易得在腫瘤綜合防治中越來越受到關注?？鄥A是提取于豆科植物苦參、苦豆子、廣豆根等中草藥的活性成分。近年來，有關苦參堿類抗腫瘤機制的研究目前已成為抗腫瘤中藥研究的一個熱點，研究結果表明作為抗腫瘤聯合用藥在腫瘤綜合防治中具有較好的應用前景。以往研究發現，苦參堿能明顯抑制人慢粒白血病細胞K562、早幼粒白血病細胞HL-60、U937細胞增殖，誘導凋亡增加，其中抑制K562細胞內DNA復制；誘導T淋巴細胞白血病JM多個凋亡基因差異表達，其中Cpe8表達上調5倍以上。以上這些都是在白血病細胞株中的研究，苦參堿對原代白血病細胞的作用尚沒有更多報道。

本研究發現，苦參堿對原代白血病細胞也具有明顯的增殖抑制作用，呈劑量相關性。隨著時間的延長，其抑制效應有所減弱，但高濃度仍具有較強抑制效果，苦參堿0.5mg/mL在24、48h均呈現半數抑制。細胞凋亡也與腫瘤之間關系密切，正常細胞通過增生和凋亡來維持自身穩定，若兩者失衡，則會導致腫瘤發生。本次研究，24h苦參堿誘導凋亡作用顯著，其中早期凋亡占較大比例。腫瘤細胞的無限增殖與細胞周期的失控有關，G1/S是其重要的調控點。本次研究，苦參堿處理48h，原代白血病細胞G0/G1期細胞逐漸增多，S和G2期細胞比例顯著降低，顯示細胞周期阻滯于G0/G1→S期。本課題組在以往研究中發現，苦參堿可以抑制K562細胞生長，誘導其凋亡、分化，其作用可能與Bcl-2、C-myc、CyclinD1、P53的表達有關。有報道稱苦參堿作用后的K562、HL-60細胞Bcl-2蛋白表達明顯的下調，與苦參堿濃度呈反比。近年來的研究表明Bcl-2在內源性凋亡途徑中起著重要作用。另外，苦參堿作用K562細胞后，P53表達增強。P53是一種腫瘤抑制基因，對細胞生長、凋亡和DNA修復有調控作用。此外，苦參堿作用K562細胞后，伴隨著DNA合成能力的降低，C-myc的mRNA水平表達降低，CyclinD1表達增強并幾乎同步達到最高。C-myc、CyclinD1作為一種細胞周期蛋白，其表達水平受苦參堿影響，在G0期到S期的過程中起重要作用。因此，推測苦參堿對原代白血病細胞生長抑制作用可能與Bcl-2，C-myc基因表達水平的下調，CyclinD1表達增強，P53活化有關。以往的研究提供了一些可能，苦參堿抑制原代白血病細胞增殖，誘導細胞凋亡，阻滯細胞周期于G0/G1→S期，其作用機制是否與這些分子相關，還有待更深入的研究。這些涉及到的相關分子將是本課題組下一步的研究方向。

作者：白煜 朱志超 蔣麗佳 夏蕾 范靜 孫曉 盧緒章 周民 馬玲娣 單位：南京醫科大學附屬常州市第二人民醫院 中心實驗室 南京醫科大學附屬常州市第二人民醫院血液科