本站小編為你精心準備了普納替尼對人血管內皮細胞的影響參考范文，愿這些范文能點燃您思維的火花，激發您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

《藥物評價研究雜志》2015年第三期

1方法

1.1Ponatinib細胞毒活性測定采用CCK-8法[4]檢測Ponatinib對正常HUVECs的細胞毒作用。用含10%FBS的DMEM高糖培養基于37℃、5%CO2培養箱中培養HUVECs細胞，收集5～8代處于對數生長期的細胞消化、重懸、計數，以5×104/mL密度每孔100μL接種細胞至96孔板。待細胞貼壁后，去除培養液，對照孔加入不含藥物的新鮮培養液100μL，給藥組每孔加入不同濃度的含藥培養液100μL，設3個復孔，于37℃、5%CO2培養箱中繼續培養48h，每孔加入CCK-8試劑10μL，于CO2培養箱中孵育1h后，用酶標儀于450nm波長下測定吸光度（A）值。使用GraphPadprism5.0軟件擬合非線性曲線，并計算Ponatinib對HUVECs細胞的半數抑制濃度（IC50）。抑制率＝（A陰性－A樣品）/A陰性

1.2Ponatinib對細胞遷移能力影響采用體外劃痕試驗[5]觀察Ponatinib對HUVECs細胞遷移能力的影響。將5×104/mL的HUVECs細胞接種至24孔板，每孔500μL，24h后，用滅菌的10μL槍頭在單層細胞上呈“一”字劃痕，吸掉培養液，用PBS清洗3遍，去除劃掉的細胞，每孔加入藥物濃度依次為0.01、0.05、0.10μmol/L的含藥培養液500μL，每個濃度設置3個復孔，以不含藥物的孔作為陰性對照，于37℃、5%CO2培養箱中繼續培養，直至陰性對照組劃痕兩側的細胞布滿劃痕后拍照觀察，并對各組遷移至劃痕中央的細胞進行計數，計算遷移率。遷移率＝藥物組劃痕區域細胞數/對照組劃痕區域細胞數

1.3Ponatinib對細胞成管能力影響采用體外血管形成試驗[6]考察Ponatinib對HUVECs細胞成管能力的影響。將100μL槍頭、96孔板、Matrigel基質膠置于4℃冰箱過夜預冷。于96孔板加入Matrigel基質膠50μL/孔，37℃、5%CO2培養箱中溫孵0.5～1h。取融合80%～90%HUVECs細胞以3.0×104/孔的密度接種到96孔板，分別加入10μL的含藥培養液使Ponatinib終濃度依次為0.01、0.05、0.10μmol/L，每組設3個復孔。溫孵10h后于倒置顯微鏡低倍鏡下觀察拍照，記錄各組細胞成管情況，根據管型情況進行評分：細胞形成閉合的多邊形評4分，細胞排列呈多邊形但未閉合評3分，細胞排列呈線性結構評2分，細胞未成管散在或聚集成簇評1分[7]。

1.4Ponatinib對細胞NO釋放的影響將HUVECs細胞以1×106/孔的密度接種至6孔板，24h后，每孔加入濃度依次為0.01、0.05、0.10μmol/L的含藥培養液2mL，每個濃度設置3個復孔，以不含藥物的孔作為陰性對照，于37℃、5%CO2培養箱中繼續培養24～48h，取細胞上清液100μL，按照NO硝酸還原法試劑盒說明書的方法進行檢測。

1.5統計學分析采用GraphPadprism5.0軟件進行One-wayANOVA分析[8]。數據采用x±s表示。

2結果

2.1HUVECs細胞毒作用結果表明Ponatinib對HUVECs細胞株增殖顯示出較強的抑制作用。隨著藥物濃度的升高，抑制率也升高，在0.1～10μmol/L呈現出典型的濃度相關性（圖1）。使用GraphPadprism5.0軟件計算得到Ponatinib對HUVECs細胞的IC50為（0.69±0.05）μmol/L。另外，0.01、0.05、0.10μmol/L濃度的Ponatinib對HUVECs細胞的抑制率小于10%，對細胞的增殖影響較小，可作為Ponatinib的非毒性劑量用于考察該藥物對細胞遷移、成管及NO水平的影響。

2.2細胞遷移能力影響相同作用時間下，給藥組的細胞向劃痕中央遷移的數量明顯少于對照組，說明經藥物處理后的HUVECs細胞的劃痕愈合能力與對照組相比較差，且隨著Ponatinib濃度的增加，差異越顯著（P＜0.05）（圖2和表1），即Ponatinib對血管內皮細胞遷移能力的影響呈劑量相關性，藥物濃度為0.01μmol/L時已經達到半數抑制率。

2.3細胞成管能力的影響由HUVECs細胞成管圖像可得，不同濃度Ponatinib作用下，HUVECs細胞在Matrigel基質膠上血管形成情況存在顯著差異（圖3）。成管評分結果顯示，0.05、0.10μmol/L的Ponatinib組評分均顯著低于對照組（P＜0.05）（圖4），說明非毒性劑量的Ponatinib能劑量相關地抑制HUVECs細胞的血管形成能力。

2.4細胞NO釋放水平影響不同濃度Ponatinib處理HUVECs細胞24h和48h后，采用硝酸還原法間接檢測細胞上清液的NO濃度，結果顯示，相同作用時間下，給藥組的細胞培養液中的NO濃度明顯低于對照組（P＜0.05）（表2），表明Ponatinib抑制HUVECs細胞NO的合成與釋放，且作用時間越長，NO濃度降低越顯著。

3討論

Ponatinib為典型的靶向抗癌藥物，為小分子多激酶抑制劑，主要作用于BCR-ABL、血管內皮生長因子受體（VEGFR）等多種激酶。FDA相關資料報道，Ponatinib誘發血栓及其他血管毒性與Ponatinib對VEGFR的抑制作用有關，并預測可能與索拉菲尼（Sorafenib）、帕唑替尼（Pazopanib）、舒尼替尼（Sunitinib）及貝伐單抗（Bevacizumab）等VEGF信號通路（VSP）抑制劑血管不良反應機制密切相關[9]。近年來，VSP抑制劑如索拉菲尼等引發的血管毒性不良反應頻繁報道[10]。VSP抑制劑通過阻斷VEGF-VEGFR相互作用，阻斷其下游信號PI3K/AKT/eNOS等通路的傳遞，進而影響血管內皮細胞的增殖、遷移及血管形成等正常生理功能，導致血管內皮損傷[11]；另外，當血管內皮細胞功能受損時，其凝血與抗凝血、纖溶與抗纖溶的平衡會失調[12]。而凝血系統激活、纖溶系統失活及血小板黏附聚集是血栓形成的重要環節。NO是由血管內皮細胞產生的一種氣體信號分子，通過促進血管舒張、抑制血小板聚集和白細胞黏附調節血管的功能[13]。正常生理狀態下，機體主要通過AKT/eNOS通路調節p-eNOS的表達，進而調控血管內皮細胞對NO的合成釋放來實現對血管收縮和舒張功能的調節[14]。NO活性降低會誘發多種病理變化，包括改變內皮的抗凝功能，干擾內皮的生長和再生功能[15]。

本文以此為研究依據，從Ponatinib對正常血管內皮細胞的功能影響方面初步考察Ponatinib致血栓的相關機制。研究發現，Ponatinib對HUVECs細胞的IC50為（0.69±0.05）μmol/L，而45mg單次口服劑量的Ponatinib在惡性血液病患者體內的血藥濃度峰值（Cmax）為（0.161±0.098）μmol/L[16]，即Cmax范圍為0.063～0.25μmol/L，結合細胞毒性實驗數據分析，在此濃度范圍內的Ponatinib對人血管內皮細胞有不同程度的毒性作用；另外，本研究還發現低于人體內Cmax的Ponatinib（0.01～0.1μmol/L）能夠顯著抑制HUVECs細胞的遷移、血管形成及NO的釋放（P＜0.05）。提示Ponatinib可能通過抑制內皮細胞增殖、遷移、血管形成，影響NO合成導致內皮細胞功能障礙，從而改變血管內皮的抗凝、生長及再生功能，最終誘發動靜脈血管狹窄、血栓等病理變化。對PI3K/AKT/eNOS等信號通路相關機制有待進一步研究。目前，Ponatinib在臨床治療中具有不可替代性，因心血管毒性影響其使用，期待該藥全面評估安全性并通過改造恢復其臨床廣泛應用。

作者：張亞楠 孫繼紅 黃新益 項儀賓 余伯陽 單位：中國藥科大學 南京圣和藥業股份有限公司