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《營養學報》2016年第一期

摘要：

目的研究海參皂苷(seacucumbersaponins,SCS)對乳清酸誘導的大鼠非酒精性脂肪肝(nonalcoholicfattyliverdisease,NAFLD)的改善及膽固醇代謝的影響。方法通過膳食乳清酸誘導產生NAFLD模型，將大鼠按體重隨機分為正常對照（CN）、乳清酸模型（oticacid,OA）、皂苷低劑量(0.01%SCS)、皂苷高劑量組(0.05%SCS)4組，飼喂10d后觀察其血清、肝臟脂質及膽固醇代謝相關基因mRNA表達量。結果：相比對照組，模型組血清和肝臟中總膽固醇含量升高，喂食高劑量海參皂苷后，血清和肝臟總膽固醇濃度分別降低了27.0%(P<0.01)和24.7%(P<0.05)。海參皂苷顯著抑制了膽固醇合成限速酶羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMG-CoAreductase)以及膽固醇調節元件結合蛋白-2(SREBP-2)的基因表達，但對低密度脂蛋白受體(LDLR)的基因表達無顯著影響，對膽固醇7α-羥化酶(CYP7A)的基因表達并沒上調。結論：海參皂苷可顯著抑制肝臟膽固醇的合成，降低血中膽固醇濃度，改善乳清酸誘導的大鼠脂肪肝。[營養學報，2016，38（1）：67－70]

關鍵詞：

海參皂苷；脂肪肝；膽固醇

脂肪肝與2型糖尿病、代謝綜合癥[1]和心腦血管疾病[2]密切相關，臨床上分為酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝。非酒精性脂肪肝(NAFLD)是一種無過量飲酒史，排除病毒性肝炎、自身免疫性肝病等原因，以肝細胞脂肪變性和脂質貯積為特征的臨床病理綜合征,包括：脂肪變性、脂肪性肝炎和肝硬化等病癥[3]。近年來我國NAFLD發病人群逐年增加，并有望成為肝病的首要病因。因此,預防和治療亟待解決。海參皂苷(seacucumbersaponins，SCS)是海參的次級代謝產物，為海參特有的一類三萜皂苷，有包括提高免疫力，抗腫瘤抑制血管新生等良好生物活性[4-5]，動物實驗證實SCS有良好降脂效果，可改善肝功能[6]。但膽固醇代謝異常也是脂肪酸形成的重要原因[7]，以往研究中很少關注。本研究探討SCS對膽固醇代謝的影響及機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑：總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒（北京中生北控生物科技公司）；Trizol（美國Invitrogen）；DNTP（日本TAKARA）；RNAaseinhibit（美國Roche）；ReverTraAce、SYBRGreenIMasterMix、RandomPrimer（日本TOYOBO）；引物由上海生工公司合成；其他生化試劑為國產分析純。

1.1.2儀器：酶標儀(Model680型,美國BiAD）；分光光度計（UV-2550型，日本島津）；臺式離心機（TGL-16G型，上海安亭科學儀器廠）；旋轉蒸發儀（LABOTA4000型，德國Heidolph），RealtimePCR儀（Prism7500型，美國ABI）。

1.1.3動物：健康Wistar大鼠28只，雄性，5w，體質量100～120g，SPF級北京維通利華公司。

1.2方法

1.2.1SCS制備：將革皮氏海參干燥后研成粉末后，加60%乙醇熱回流抽提6次，合并抽提液，減壓濃縮后，過HP-20型大孔樹脂，依次用水和80%乙醇洗脫，收集80%乙醇洗脫液減壓濃縮，干燥后得海參皂苷(SCS)，其含量為75%。

1.2.2動物分組及飼料配制：28只Wistar按體質量隨機分成：正常對照(control，CN)、乳清酸模型(ticacid，OA)、SCS低、高劑量(SCS0.01%，0.05%)4組，每組7只，單籠飼養。動物飼料按總蛋白質比例20%和油脂比例10%標準配制，飼料中其它成分按AIN93配方[8]，OA組添加1.0%的乳清酸，CN組不添加乳清酸，SCS高低劑量組加入對應劑量SCS（表1）。

1.2.3動物實驗：動物置鋼絲籠內單只喂養，室溫（23±2）℃，12/12h明暗交替，自由攝食飲水，連續喂養10d。于末次飼喂后，禁食不禁水10h，乙醚麻醉后，腹部大動脈放血處死；取肝臟－80℃保存；收集血液，分離血清。

1.2.4血清脂質濃度測定：血液在室溫靜置30min后，7000r/min離心15min后獲得血清，按試劑盒說明測定TC、TG、LDL-C濃度。

1.2.5肝臟脂質濃度測定：參Floch等[9]方法提肝脂。參試劑盒方法測肝臟TC、TG含量，參Bartlett等[10]方法測肝總磷脂(phospholipid，PL)。

1.2.6肝臟膽固醇代謝相關基因的mRNA表達：實時熒光PCR法測定，采用Trizol提取肝臟總RNA，逆轉錄和PCR反應按試劑盒操作進行。羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMG-CoAreductase,HMG-CoAr)，膽固醇調節元件結合蛋白-2(SREBP-2)，低密度脂蛋白受體(LDLR)，膽固醇7α-羥化酶(cholesterol7a-hydroxylase，CYP7A1)的PCR的熒光引物熒均采用PrimerPremier5.0軟件設計，其具體的引物序列見表2。各酶mRNA表達量以18sRNA比值表示，并將對照組定為100%。

1.3數據統計處理用SPSS11.0統計軟件，結果以x±s表示，多組間差異分析采用Fisher’sPLSD檢驗，P＜0.05為有顯著差異。

2結果

2.1SCS對大鼠成長的影響(表3)各組大鼠實驗前后的平均攝食量和體質量均無顯著差異。OA組大鼠肝重明顯大于CN組，顯示脂肪肝造模成功，SCS組肝重無顯著差異。

2.2SCS對大鼠血脂濃度的影響(表4)飼料中添加1.0%OA組中，血清TG、TC、LDL含量顯著升高。而添加0.01%SCS、0.05%SCS受試物后，血清TC含量分別降低11.0%，28.9%，TG含量分別降低16.4%，47.5%，LDL含量分別降低10.5%，27.4%。

2.3SCS對大鼠肝脂肪濃度的影響(表5)結果顯示，模型組肝臟TC、TG含量比正常組分別提高了83.2%、796.0%，顯示脂肪肝模型成功。與OA組比，給予低、高劑量SCS后，肝臟TC含量分別降低22.5%，25.3%，肝臟TG含量分別降低45.3%，72.8%，但各組間肝臟PL含量無顯著變化。

2.4SCS對肝臟膽固醇代謝相關基因mRNA表達量的影響(圖1)OA組大鼠肝臟SREBP-2和HMG-CoA還原酶的基因表達量均顯著上調，喂食0.05%SCS后，兩者的mRNA表達量明顯受到抑制(46.0%，P＜0.01；44.3%，P＜0.05)。但是LDLRmRNA表達量無顯著差異，另外，SCS組大鼠肝臟CYP7A表達量明顯低于OA組(46.3%，P＜0.05)。

3討論

膽固醇的代謝主要包括膽固醇的合成、分解、吸收、逆轉運等過程。膽固醇的合成過程主要是在肝臟中進行的，在膽固醇合成的過程中，HMG-CoA還原酶是限速酶[11]，它能調節膽固醇的合成。而調控HMG-CoAR表達的關鍵調控因子即固醇調節元件結合蛋白2（SREBP2）是固醇調節元件結合蛋白（SREBPS）的存在亞型之一，SREBPS有3中亞型即：SREBP1a、SREBP1c和SREBP2。SREBP2主要調控膽固醇代謝相關基因的表達，其能與固醇調節元件1（Sterolregulatyelement-1，SRE-1）特異性結合，SRE-1是低密度脂蛋白受體(LDLR)和HMG-CoAR這些基因的增強子，SREBP2刺激含有SRE-1的基因表達增強，從而激活HMG-CoAR基因表達[12-13]。LDLR是一種細胞表面糖蛋白，主要功能是結合并內吞LDL,在維持血液中膽固醇平衡中起關鍵作用[25]。LDL是血液中運輸膽固醇的主要脂蛋白，血液中大部分膽固醇由LDL攜帶，其中90%的LDL是通過LDLR介導的內吞作用清除的[14]。本實驗結果顯示，SCS對肝臟LDLRmRNA表達量無顯著影響，說明海參皂苷對血清膽固醇濃度的降低作用與肝臟對LDL的清除能力增加無關。

膽固醇的分解代謝也是在肝臟中進行的，主要是經過一系列的反應將膽固醇轉化為膽汁酸，是膽固醇外排的主要途徑，在這個過程中起關鍵限速作用的酶是CYP7A1[15]。在本實驗中，當添加1.0%OA時，肝臟膽固醇含量升高，作為回應，CYP7A1mRNA表達量上升；在加入海參皂苷時，肝臟膽固醇含量升高，作為回應，CYP7A1mRNA表達量也相應的下調。綜上，海參皂苷作為海參中一種重要的活性物質，可通過減少肝臟中膽固醇的合成途徑參與膽固醇的代謝調節，改善脂肪肝，這為海參皂苷在調節脂質代謝方面的應用提供了科學依據。

作者：王丹 丁琳 董平 薛勇 薛長湖 王玉明 單位：中國海洋大學食品科學與工程學院