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《中國神經精神疾病雜志》2015年第十一期

帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)是一種以腦內多巴胺能神經元進行性丟失和路易小體形成為特征的神經退行性疾病，主要表現為運動遲緩、肌強直、震顫、姿勢步態異常等運動障礙，亦常伴有嗅覺減退、睡眠障礙等多種非運動癥狀。目前臨床上主要以藥物治療、康復訓練、腦深部電刺激等對癥治療為主，尚沒有控制疾病發展的有效手段。基因治療技術通過將目的基因導入相關腦區影響特異性蛋白質表達，有可能延緩多巴胺能神經元的丟失或糾正神經遞質失衡。近期有多項臨床研究嘗試通過立體定向手術導入靶基因，從保護多巴胺能神經元、提高多巴胺遞質、拮抗抑制性神經遞質等不同角度治療PD[1-2]。本文就相關研究進展進行綜述。

1神經營養因子基因治療策略

在PD的病程中，多巴胺能神經元的變性壞死是逐漸發生的，故在疾病發展過程中保護殘存的多巴胺能神經元、防止其繼續死亡有望阻斷PD進展。研究表明[3]，轉化生長因子α（transforminggrowthfactor-α，TGF-α）、血小板源性生長因子（plateletderivedgrowthfactor，PDGF）、腦源性神經營養因子（brainderivedneurotrophicfactor，BDNF）、神經營養因子（neurturin，NTN）及膠質源性神經營養因子(glialcellline-derivedneurotrphicfactor，GDNF)均對多巴胺神經元有營養保護作用。這些措施在各種帕金森病動物模型上均被證實可提高多巴胺能神經元的存活率，阻止神經元進一步變性，從而改善運動癥狀。其中以GDNF和NTN研究最多，且均進入臨床研究階段。

GDNF為轉化生長因子-β超家族成員之一，但與轉化生長因子-β超家族中其他成員不同，GDNF是通過激活酪氨酸激酶Ret來激活細胞內下游的信號通路[4]。并且GDNF對多巴胺能神經元具有神經保護和修復作用，能促進多巴胺能神經元的存活及其形態分化，并增加外源性多巴胺吸收的親和性。有研究發現，將慢病毒介導的GDNF基因導入MPTP誘導的PD猴模型的紋狀體和黑質中，結果發現TH免疫陽性神經元增加7倍，表明GDNF能夠調節中腦腹側多巴胺神經元的存活及表型，并能使黑質神經元向多巴胺神經元轉化從而彌補局部神經元的缺失[5]。然而GDNF的長期應用可能會同時影響到正常的神經元的功能：研究顯示，GDNF在紋狀體的長期過表達可下調正常黑質紋狀體系統多巴胺神經元的TH表達水平，黑質致密部THmRNA的表達降著減少[6]。在I/II期臨床試驗中，顯示出了部分療效：入選的34例PD患者中，GDNF組患者雙側殼核輸注重組人GDNF，治療6個月后GDNF組和對照組UPDRS運動評分改善分別平均為10%和4.5%；PET示GDNF組患者背側殼核18F-左旋多巴吸收值增加23.1%，而對照組無明顯變化[7]；但是，GDNF組患者全都出現了不良事件，主要表現為感覺異常、頭痛、上呼吸道感染、運動障礙等，而對照組患者全部出現以運動障礙為主的不良事件。研究者認為這可能與GDNF劑量過高或其擴散吸收需要較長的時間有關，將來的研究可通過設計細胞或病毒載體的表達系統，調控GDNF穩定長期表達。NTN與GDNF有相同的結構和功能特性，在體內能通過激活GDNF家族受體而促進多巴胺能神經元的存活[8]。

在MPTP誘導的PD猴模型的實驗中，立體定向注射2型腺相關病毒介導的NTN（AAV2-NTN），治療后4個月發現存活的黑質神經元增加及運動損害改善，并且治療后NTN持續表達長達12個月。隨后進行了I期臨床試驗，入選的12例PD患者經立體定向手術在雙側殼核內注射不同劑量AAV2-NTN[9]?；颊卟糠诌\動功能得到改善，不服藥時UPDRS運動評分平均改善14分，PET示治療后18F-左旋多巴吸收無變化，手術操作耐受良好，1年后均無嚴重不良事件發生。接著進行了II期臨床試驗，38例患者為治療組，通過頭顱立體定向技術向雙側殼核內緩慢微量輸注共80uLAAV2-NTN（5.4×1011單位），20例患者進入假手術對照組，僅接受頭顱鉆孔定位（不穿透顱骨內表面）而不給予任何液體[10]；治療后12個月“不服藥時UPDRS評分”組間無顯著差異，PET掃描示18F-左旋多巴吸收值組間亦無顯著差異，但在治療后18個月，治療組患者UPDRS評分的降低顯著優于對照組，提示NTN基因治療起效緩慢，可能需更長的隨訪期才能體現出療效差異。實驗組有13例出現了嚴重不良事件,對照組有4名出現嚴重不良事件,研究者分析可能與手術操作相關。初步研究顯示，NTN基因治療可能有助于改善帕金森病患者運動癥狀，但其起效緩慢，且安全性還需進行多中心臨床試驗進一步評估。

2酶替代基因治療策略

多巴胺是由酪氨酸在多種酶的協同催化作用下，經過復雜的生化反應最終生成的。其中，有3種酶對多巴胺的高效合成最為重要：酪氨酸羥化酶（Tyrosinehydroxylase，TH）在黑質紋狀體將L-酪氨酸轉變成左旋多巴，隨之經芳香族氨基酸脫羧酶（aromaticL-aminoaciddecarboxylase，AADC）轉變多巴胺；GTP-環化水解酶1（GTPcyclohydro⁃lase-1，GCH1）是合成TH輔助因子——四氫生物蝶呤的限速酶[11]。帕金森病患者黑質多巴胺能神經元進行性變性，導致多巴胺顯著性下降，而通過長期口服左旋多巴來增加多巴胺含量會產生一系列嚴重的運動并發癥[2]。酶替代基因治療是通過在紋狀體表達多巴胺合成的關鍵酶來提高多巴胺含量，從而改善臨床癥狀，并減少口服藥物劑量。

2.1AADC基因治療有研究表明，表達AADC的細胞在進展期PD患者服用左旋多巴的治療中起重要作用，能顯著提高外源左旋多巴的脫羧效率，使其更高效地轉換為多巴胺，從而降低左旋多巴需求量及其不良反應[12]。在此基礎上研究者開展了一系列AADC基因治療PD的嘗試：在AADC基因聯合c17.2神經干細胞移植入大鼠紋狀體內的實驗中，實驗組大鼠行為學明顯改善，且紋狀體TH陽性細胞明顯增多[13]；在MPTP誘導的猴PD模型中單側紋狀體輸注腺相關病毒介導的AADC（AAV-AADC），FMT-PET掃描示尾狀核AADC表達信號隨著時間延長而增加；行為學表現得到一定改善，但部分出現不良反應，如肢體活動過度、刻板動作、幻覺、注意力分散；長期隨訪研究證實治療效應持續8年，并且沒有其他嚴重不良事件出現[14]。隨后開展了I期臨床試驗，在中重度PD患者雙側殼核內輸注AAV-AADC，且使用2個不同劑量組（9×1010和3×1011單位），UPDRS總評分及運動評分得到一定改善，FMT-PET掃描信號顯示AADC表達增加，分別為30%（低劑量組）、75%（高劑量組）[15]。但有3例患者出現顱內出血，可能與神經外科手術操作有關；有4例患者隨后（基因治療10~15個月后）需進一步行DBS治療[16-17]。目前研究表明，AAV-AADC基因治療可能有效，相關不良事件很可能與基因載體輸注的手術方法有關。正進行的I/II期臨床試驗有助于進一步評估AAV-AADC的療效及安全性。

2.2GCH1和TH基因治療除了AADC，帕金森病患者紋狀體內TH、BH4與GCH1的表達也低于正常，通過提高紋狀體局部GCH1的表達，可彌補BH4的耗損，同時可穩定TH的表達并增強其活力。與AADC相比，聯合GCH1和TH是一種組合酶基因治療策略。研究顯示，在大鼠PD模型單側紋狀體輸注AAV-TH-GCH1共表達基因，治療4周后大鼠運動功能改善，且改善程度與紋狀體內多巴胺恢復水平相關；免疫組化染色示紋狀體和部分皮質區域出現大量轉入基因表達但同時伴有蒼白球神經元的丟失[18]。隨后研究者在大鼠PD模型植入可穩定調控多巴胺生成的基因表達系統，通過偶聯二氫葉酸還原酶（dihydrofolate，DD）形成重組DD-GCH1基因組，給予甲氧芐氨嘧啶（trimethoprim，TMP）調控多巴胺的生成[19]。結果顯示給TMP后，AAV-TH-DD-GCH1組大鼠行為學顯著改善并持續到33周，生成多巴胺含量較對照組高且穩定，其療效與TMP給藥劑量和時間相關。目前相關研究尚未進入臨床研究階段。

2.3AADC，GCH1，TH基因聯合治療通過構建慢病毒載體（Lentiviral）同時轉導AADC、GCH1、TH這三種多巴胺合成的關鍵酶基因來增加多巴胺的合成，這一方案能夠明顯改善PD大鼠的運動功能[20]。進一步研究發現，在MPTP誘導猴PD模型注射這種病毒載體12個月后，運動功能改善，并且沒有引起其他運動障礙[21]。隨后研究者開展了I/II期臨床試驗，設計三種不同劑量的聯合基因治療組（Lenti-AADC-TH-GCH1），通過立體定位技術在PD患者雙側紋狀體輸注Lenti-AADC-TH-GCH1[22]。隨訪結果顯示：UPDRS運動評分(不服藥時)較基線明顯減少；無嚴重不良事件發生；僅有2例患者隨后接受了腦深部電刺激術。4年隨訪數據初步證明這一基因聯合治療方案的安全性及有效性，具有較好的發展前景。

3GAD基因治療策略

PD黑質神經元的退變導致紋狀體多巴胺的顯著耗竭，主要抑制性傳出神經核團——黑質網狀部及蒼白球內側部在過度激活的丘腦底核(subthalamicnucleus，STN）核團的驅動下傳出過多的抑制性沖動，從而引起以運動障礙為主的PD癥狀——靜止性震顫、肌強直、運動遲緩和步態紊亂[23]。STN局部高頻刺激（deepbrainstimulation，DBS）是進展期PD治療的有效手段，其通過阻斷STN神經元的活性而降低STN神經元傳出的抑制性神經沖動，同時提高黑質網狀部局部神經遞質Υ-氨基丁酸（GABA）的濃度[24]。因此，應用基因治療提高STN及其終末區局部GABA神經遞質的濃度可改善PD的臨床癥狀。GABA為腦內主要的抑制性神經遞質，可由谷氨酸脫羧酶的兩種異構體GAD65和GAD67產生，將GAD65基因轉入大鼠STN，可顯著改善PD大鼠模型的癥狀，而局部轉染GAD67基因卻無這一效果[25]。用AAV-GAD65處理6-OHDA誘導的PD小鼠，電生理記錄發現GABA釋放增加；隨之刺激STN，運動功能得到改善。接著進行AAV-GAD治療MPTP誘導的PD猴的研究，發現帕金森病臨床指標顯著改善，并且療效超過56周，注射部位FDG-PET活性相應明顯增加[26]。該研究結果初步顯示GAD基因治療安全，且無不良事件發生。在隨后的I期臨床試驗中，入選12例PD患者，單側丘腦底核經立體定向技術注射AAV-GAD65,治療后12個月UPDRS運動評分顯著改善，同側FDG-PET吸收增加，同側丘腦的代謝活性明顯減弱[27]，在圍手術期內未出現與治療有關的不良事件。研究者又開展了II期臨床試驗，治療組隨機分配22例患者（接受雙側丘腦底核注射AAV2-GAD），假手術組23名患者，治療后6個月，治療組UPDRS評分結果較對照組略有改善但差異無統計學意義(P=0.19)，無嚴重不良事件發生，術后MRI未顯示丘腦底核損害，副作用相對輕微，包括頭痛和惡心[28]。AAV2-GAD的臨床試驗研究表明該方法相對安全，還需進行更多的研究來比較這些結果療效與傳統DBS治療的療效。

4基因治療選用的載體

目前，病毒載體可以將外源基因成功帶入PD動物模型的中樞神經系統，對維持攜帶基因的表達有特定的優勢(通過形成游離基因或整合到宿主基因)?，F階段應用于臨床試驗的主要為AAV和慢病毒載體。AAV是一種輔助依賴型的細小病毒，由4.7kb的單鏈DNA和包裹的二十面蛋白衣殼組成，在遞送基因時不影響正?；虻墓δ?，可長期穩定表達外源基因[29]。AAV有多種亞型，迄今以血清型命名AAV亞型分為AAV1-AAV12，主要以人類和靈長類動物為宿主，其中AAV1-6是從人類組織中分離獲得。盡管不同AAV血清型的病毒都具有二十面體結構，但其衣殼蛋白在序列與空間構象上具有多樣性，使得其細胞結合受體以及細胞嗜性存在顯著差異[30]。AAV2和AAV3的主要受體為硫酸肝素蛋白多糖；AAV4的受體為O-連接的唾液酸；AAV1、AAV5和AAV6的受體為N-連接的唾液酸；AAV8的受體為層黏連蛋白受體LamR；AAV9對心肌的親和性較高[31]。目前用于PD研究的主要有AAV2、AAV8和AAV9，且AAV載體在末端重復序列之間最多可攜帶長4.5kb的外源基因[32]。慢病毒為一類逆轉錄病毒的總稱，由慢病毒改建而來的載體系統以其高效而穩定的基因轉移效率及低免疫原性成為近年來研究者們的常用選擇[33]。慢病毒載體主要具有以下特點：既可以轉染處于有絲分裂活躍期細胞，又可以轉染分裂緩慢及處于分裂終末期細胞；由慢病毒載體攜帶整合入宿主基因組的目的基因對轉錄沉默作用有較強的抵抗力；可兼容多個轉錄啟動子；經過改建后的慢病毒載體可容納約10kb的外源基因[34]。

5基因治療手術方式

目前向PD患者腦內輸注攜帶目的基因的載體均通過立體定向技術實現，病毒載體將目的基因整合入靶細胞基因組，并調節其穩定表達。注射靶區主要為與帕金森病病理改變密切相關的部位，不同研究依攜帶基因的不同而選擇不同的注射部位：紋狀體（Lenti-AADC-TH-GCH1），術后患者出現頭痛、腦水腫、硬膜下血腫（進針手術部位）等[22]；殼核（AAV2-NTN、AAV-AADC），患者出現與手術操作相關的并發癥如驚厥、腦水腫、出血、短暫精神改變、尿潴留等[10]；丘腦底核（AAV2-GAD），術后患者出現頭痛、惡心等[28]。這些臨床研究均未出現與基因治療藥物相關的不良事件，其并發癥主要與手術操作相關，改進手術方法及增強術后護理有可能減少相關并發癥的發生。

6展望

多項臨床前期實驗、小規模I期和II期臨床研究顯示，基因治療對緩解PD癥狀、改善PD運動功能有較好的療效，并且未出現與目的基因、病毒載體相關的并發癥，很可能成為PD治療的新方法，特別以慢病毒介導的AADC、GCH1、TH聯合基因治療方案展現出較好地轉化前景。在此基礎上，選擇合適的病毒載體攜帶不同基因精確地植入相關腦區，并探索植入基因長期表達的調控策略，如：探索調控藥物的劑量與時間窗關系，從而使目的基因能以生理方式穩定表達，提高基因治療的效果，阻止PD的病理進展。不同治療策略之間優缺點的比較尚有待進一步研究，同時需完善手術方式，減少與手術操作相關的并發癥，改善患者生活質量。

作者：蔡瓊 靳令經 單位：同濟大學附屬同濟醫院神經內科