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1材料與方法

1.1方法

1.1.1細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理：MKN1細(xì)胞株用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)、傳代。實(shí)驗(yàn)用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)至60%匯合度時(shí)，分別加入2μmol/L或10μmol/L的5⁃Aza⁃CdR處理液，對(duì)照組使用不含5⁃Aza⁃CdR的普通完全培養(yǎng)液。每隔24h換液1次，培養(yǎng)72h后處理細(xì)胞用于后續(xù)的相關(guān)檢測(cè)。

1.1.2亞硫酸氫鹽修飾DNA和BSP反應(yīng)：采用Blood＆CellCultureDNAMiniKit試劑盒，按說(shuō)明書(shū)步驟提取各組細(xì)胞基因組DNA。取500ngDNA按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾及純化。使未甲基化的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶（T），而甲基化的Cm不變。以修飾后基因組DNA為模板，用GoT⁃aqDNA聚合酶進(jìn)行bnip3基因啟動(dòng)子擴(kuò)增。用MethPrimer軟件設(shè)計(jì)甲基化引物，上游：5′⁃TTAAAGTGTTGAGATGAAAGATATG⁃3′，下游：5′⁃AATCCAAATCCAAATATCAAAATAC⁃3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為288bp。反應(yīng)條件為95℃10min，95℃30s、56℃30s、72℃30s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用膠回收試劑盒回收，純化目的片段，連接pGEM⁃T載體，4℃孵育過(guò)夜。取6μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)大腸桿菌，藍(lán)白篩選陽(yáng)性克隆，送菌液測(cè)序。

1.1.3RT⁃PCR檢測(cè)BNIP3基因表達(dá)：采用Axy⁃PrepTotalRNAMiniprepKit試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)成cDNA后進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，BNIP3引物序列：上游：5′⁃CCACCTCGCTCGCAGACACCAC⁃3′，下游：5′⁃GAGAGCAGCAGAGATGGAAGGAAAAC⁃3′，長(zhǎng)度為317bp。作為內(nèi)參的人β⁃actin引物序列：上游：5′⁃CCAGATCATGTTTGAGACCT⁃3′；下游：5′⁃TTGAAGGTAGTTTCGTGGAT⁃3′，長(zhǎng)度為480bp。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃5min變性，95℃復(fù)性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，4℃暫時(shí)保存。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。產(chǎn)物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)（Tanon⁃2500R）拍照及分析表達(dá)情況。

1.1.4染色質(zhì)免疫沉淀：采用ChIP試劑盒按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行如下操作：用1%甲醛PBS交聯(lián)固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物，加入交聯(lián)終止液5min，2500r/min、4℃離心10min，PBS洗脫2次；加裂解液冰上裂解5min，酶法消化切割至200~1000bp的染色質(zhì)小片段；之后，染色質(zhì)與DNMT1特異性抗體及DNA/Pro⁃teinGAgorose4℃顛轉(zhuǎn)過(guò)夜，洗脫蛋白/DNA復(fù)合物，純化回收DNA。針對(duì)BNIP3啟動(dòng)子區(qū)的引物序列：上游：5′⁃CCGCGCCGCCTCCTCCGCCTCAC⁃3′；下游：5′⁃GCTCCGACCTCCGCTTTCCCACCGCC⁃3′。PCR擴(kuò)增條件：95℃5min，95℃30s，59℃30s，72℃30s，72℃10min，30個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)（Tanon⁃2500R）拍照及分析表達(dá)情況。

1.2統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)用x±s表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用t檢驗(yàn)，甲基化率比較用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1MKN1細(xì)胞中BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)

2.1.1BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島序列分析：在ENSEMBLE上找到BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)的原始序列，利用MethPrimer分析，按照“長(zhǎng)度超過(guò)200bp，GC含量大于50%，CpG出現(xiàn)率（觀察值／預(yù)測(cè)值比例）≥0.6”的參數(shù)定義［8］，可以找到BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)自轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游966bp至下游86bp之間長(zhǎng)度為1052bp的CpG島。圖1為BSP法擬分析其中長(zhǎng)288bp、含14個(gè)CpG位點(diǎn)的DN段。

2.1.2BSP結(jié)果：以亞硫酸氫鹽修飾后的DNA為模板行PCR，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接T載體，轉(zhuǎn)化增菌，PCR擴(kuò)增鑒定陽(yáng)性克隆。圖2為隨機(jī)挑取的5個(gè)克隆的菌液PCR鑒定結(jié)果，在約288bp處可見(jiàn)理想的目的條帶。

2.1.3測(cè)序結(jié)果分析：陽(yáng)性克隆進(jìn)一步測(cè)序，將亞硫酸氫鹽修飾后的序列與原序列進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)非CpG位點(diǎn)的“C”全部轉(zhuǎn)化為“T”，證明亞硫酸氫鹽修飾效果可信。擴(kuò)增的BNIP3啟動(dòng)子區(qū)片段包含有14個(gè)CpG位點(diǎn)，與原始BNIP3基因序列比對(duì)，各CpG位點(diǎn)甲基化概率分別為100%、80%、100%、100%、80%、100%、100%、100%、80%、100%、100%、80%、100%、100%。見(jiàn)圖3及圖4。

2.25⁃Aza⁃CdR對(duì)MKN1細(xì)胞中BNIP3表達(dá)的影響采用不同濃度5⁃Aza⁃CdR處理MKN1細(xì)胞，作用72h后，對(duì)照組、2μmol/L5⁃Aza⁃CdR處理組和10μmol/L5⁃Aza⁃CdR組的BNIP3mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.389±0.018，0.515±0.024，0.839±0.014。10μmol/L5⁃Aza⁃CdR組的BNIP3mRNA表達(dá)量較對(duì)照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖5。

2.35⁃Aza⁃CdR對(duì)MKN1細(xì)胞中BNIP3基因啟動(dòng)子甲基化的影響10μmol/L的5⁃Aza⁃CdR處理細(xì)胞72h后，BNIP3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)有所逆轉(zhuǎn)（圖6），啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化率（74.2%±9.37%）與對(duì)照組（圖4）甲基化率（94.3%±19.80%）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.4BNIP3啟動(dòng)子與DNMT1蛋白的結(jié)合用ChIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MKN1細(xì)胞中DNMT1與BNIP3啟動(dòng)子區(qū)DNA的結(jié)合。結(jié)果顯示，在對(duì)照組可以檢測(cè)到DNMT1與BNIP3啟動(dòng)子區(qū)DNA的結(jié)合，而10μmol/L的5⁃Aza⁃CdR處理組與對(duì)照組相比DNMT1與BNIP3啟動(dòng)子區(qū)DNA的結(jié)合明顯減少。見(jiàn)圖7。

3討論

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)修飾的重要作用方式之一，指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5′碳位共價(jià)鍵結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)。越來(lái)越多的研究表明，DNA甲基化在癌癥的發(fā)生機(jī)制中扮演重要角色。正常生理?xiàng)l件下，人類基因組中位于啟動(dòng)子區(qū)、富含CpG二核苷酸的CpG島處于非甲基化狀態(tài)，抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島過(guò)度甲基化可誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄失活、表達(dá)沉默。BNIP3是Bcl⁃2家族中BH3⁃only亞家族的成員，具有BH3結(jié)構(gòu)域和跨膜區(qū)，屬于促凋亡蛋白，通過(guò)促進(jìn)線粒體通透性、轉(zhuǎn)運(yùn)開(kāi)放和線粒體的損傷誘導(dǎo)凋亡。Murai等［3］在66%的結(jié)直腸癌和49%的胃癌中檢測(cè)到BNIP3表達(dá)缺失。Abe等發(fā)現(xiàn)在幾乎所有的胰腺癌組織和50%的胰腺癌細(xì)胞系中未檢測(cè)到BNIP3的表達(dá)，其失活機(jī)制和DNA啟動(dòng)子區(qū)高度甲基化相關(guān)。

目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于BNIP3基因的甲基化研究基本都局限于甲基化特異PCR法，此方法的特點(diǎn)是靈敏度高，但只能對(duì)引物序列中少量CpG位點(diǎn)進(jìn)行分析，具有一定的局限性。所以關(guān)于腫瘤細(xì)胞中BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的具體位點(diǎn)還不清楚。BSP克隆測(cè)序法具有能明確目的片段中每一個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)的優(yōu)勢(shì)，是公認(rèn)的DNA甲基化分析的金標(biāo)準(zhǔn)［7］。本研究利用MethPrimer軟件分析了MKN1細(xì)胞中BNIP3基因CpG位點(diǎn)分布情況。結(jié)果顯示，BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)自轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游966bp至下游86bp之間CpG位點(diǎn)分布密集，存在長(zhǎng)度為1052bp的CpG島。本研究中利用BSP克隆測(cè)序法對(duì)BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)中（+21bp~-267bp）長(zhǎng)288bp、包含14個(gè)CpG位點(diǎn)的DN段進(jìn)行甲基化水平的檢測(cè)，甲基化率為80%~100%。因此，首次明確了胃癌MKN1細(xì)胞中BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化位點(diǎn)，并檢測(cè)到這些CpG位點(diǎn)呈現(xiàn)高度的甲基化。

我們進(jìn)一步用去甲基化藥物處理MKN1細(xì)胞，以明確啟動(dòng)子甲基化與BNIP3基因表達(dá)的關(guān)系。5⁃Aza⁃CdR是一種高效的DNMT抑制劑，它可與DNMT不可逆性結(jié)合，具有較強(qiáng)去甲基化作用，使表觀遺傳學(xué)沉默的基因去甲基化，逆轉(zhuǎn)其惡性表型。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組MKN1細(xì)胞中BNIP3表達(dá)缺失，10μmol/L的5⁃Aza⁃CdR可誘導(dǎo)BNIP3mRNA表達(dá)明顯增加，BNIP3基因的啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化概率較對(duì)照組明顯下降，提示胃癌MKN1細(xì)胞中BNIP3基因表達(dá)缺失與啟動(dòng)子區(qū)高甲基化關(guān)系密切，該區(qū)域的CpG位點(diǎn)甲基化在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要作用。

DNA甲基化是由DNMT催化完成的。DNMT1催化甲基基團(tuán)與胞嘧啶環(huán)的結(jié)合，維持DNA復(fù)制過(guò)程中的甲基化模式，在表觀遺傳修飾中發(fā)揮重要作用，其活性及表達(dá)水平與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。近年研究報(bào)道，DNMT1通過(guò)與靶基因啟動(dòng)子DNA序列結(jié)合，介導(dǎo)DNA甲基化，調(diào)節(jié)基因表達(dá)［12，13］。我們推測(cè)DNMT1是否參與介導(dǎo)BNIP3發(fā)生DNA甲基化的機(jī)制。我們利用ChIP技術(shù)檢測(cè)DNMT1與BNIP3啟動(dòng)子區(qū)DNA的結(jié)合狀態(tài)。結(jié)果顯示，MKN1細(xì)胞中DNMT1能與BNIP3啟動(dòng)子區(qū)DNA結(jié)合。5⁃Aza⁃CdR能夠明顯抑制DNMT1與BNIP3啟動(dòng)子的結(jié)合。提示5⁃Aza⁃CdR降低DNMT1與BNIP3啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合能力，部分逆轉(zhuǎn)BNIP3的甲基化狀態(tài)，是導(dǎo)致MKN1細(xì)胞中BNIP3表達(dá)上調(diào)的重要原因。

綜上所述，本研究首次明確了胃癌MKN1細(xì)胞中BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的具體位點(diǎn)，證實(shí)了MKN1細(xì)胞中BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)存在高甲基化，BNIP3基因表達(dá)受啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化調(diào)控，甲基化的發(fā)生與DNMT1和BNIP3基因啟動(dòng)子結(jié)合有關(guān)。揭示了BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化的機(jī)制，有助于從表觀遺傳學(xué)角度揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制，為胃癌的基因治療提供理論基礎(chǔ)。

作者：沈薇劉坤隋璐鄒丹胡金瑤單位：沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室生理教研室2012級(jí)醫(yī)學(xué)影像專業(yè)