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1方法與步驟

1.1LRP免疫細胞化學將PC-3、LNCaP、PC-3/Bicalutamide、LNCaP/Bicalutamide、PC-3/Bica-lu-tamide-DHT及LNCaP/Bicalutamide-DHT細胞株分別接種于盛有蓋玻片的24孔板上，待細胞布滿蓋玻片后取出。采用4%的多聚甲醛固定液放置在溫度為4℃的條件下約15min，以PBS磷酸鹽緩沖液洗滌3次，室溫條件下采用20%的正常羊血清孵育半小時，分別加入LRP鼠單克隆抗體IgG(1:1000)，置于溫度37℃條件下2h，以PBS磷酸鹽緩沖液洗滌3次，EnVision試劑置于溫度37℃條件下半小時，采用顯色劑DAB顯色10min，以蘇木精對其染色并以樹脂封片；將蓋玻片置于顯微鏡下觀察，其中背景呈現紫藍色，有陽性產物是顯黃色或黃棕色，同時采用分析軟件對其圖像進行分析。

1.2WesternBlot檢測在冰浴中采用蛋白裂解液將PC-3、LNCaP、PC-3/Bicalutamide、LNCaP/Bi-calutamide、PC-3/Bicalutamide-DHT及LNCaP/Bi-calutamide-DHT細胞裂解13min，超聲破碎細胞，離心后取上清液置于-80℃保存備用。取少許上清液按照BCA試劑盒說明定量。100℃蛋白變性后冰浴5min，上樣。取0.5ml上樣以SDS-PAGE凝膠電泳分離細胞蛋白，至溴酚蘭剛出現終止電泳轉膜，將PVDF膜置于濕盒中以5%BSA/PBS液封閉2h，加入LRP鼠單克隆抗體IgG(1:1000)，置于搖床上，控制溫度4℃過夜，PBS磷酸鹽緩沖液洗滌15min×3次，加入兔抗鼠二抗(1:5000)，反應1h，加入AB液發光，X膠片曝光顯影，放入Bio-Rad化學發光儀進行定量分析。

1.3統計學方法所有數據均以SPSS17.0統計軟件進行分析，計數資料以率或構成比表示，采用χ2檢驗，計量資料以均數±標準差(x-±s)表示，采用t檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1LRP表達細胞免疫結果PC-3/Bicaluta-mide、LNCaP/Bicalutamide細胞系LRP表達強度較PC-3、LNCaP顯著增強(P<0.05)；經DHT誘導后，PC-3/Bicalutamide、LNCaP/Bicalutamide細胞系LRP表達強度顯著增高(P<0.05)，見表1。

2.2WesternBlot結果LRP的表達在經DHT誘導后最強，對比卡魯胺產生耐藥性的細胞株表達次之，原前列腺癌細胞株表達最弱。

3討論

前列腺癌一般在發現時已處于晚期階段，比卡魯胺作為一種抗雄激素類制劑，可以與表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)以及環王巴明等聯合使用，可抑制前列腺癌的增殖，通過雄激素受體(AR)以及Capase-3的介導，加速癌細胞的凋亡。研究表明，比卡魯胺在治療前列腺癌的初始階段可以有效的阻斷雄激素與其受體的結合。藥理研究發現，比卡魯胺可顯著性的抑制人前列腺癌細胞的增殖，誘導其凋亡，同時可以減少AR以及PSA(前列腺特異性抗原)的表達。但由于癌細胞本身具有一定的耐藥特性，再經過14~30個月的化學藥物的誘導，很容易使癌細胞的耐藥性進一步增加，同時使前列腺癌由雄激素依賴型轉變為非依賴型，進而失去治療的效果。肺耐藥蛋白(LRP)首次發現于肺癌中，LRP的過度表達可使卵巢漿液性癌、白血病母細胞、胃癌細胞、人鼻咽癌等多種細胞產生耐藥性，抑制LRP的表達，一定程度上可以提高化療的效果。研究表明LRP可參與藥物在細胞中的囊泡運輸，可使藥物包裹于囊泡內從細胞核內運至核外，并通過細胞的胞吐作用將藥物進一步運送至細胞外，使藥物失去對癌細胞的作用。

本研究通過建立耐比卡魯胺前列腺癌細胞，并以DHT對其誘導，采用免疫細胞化學法和WesternBlot檢測LRP的表達，比較LRP在人前列腺癌細胞、耐比卡魯胺前列腺癌細胞以及經DHT對其誘導后的癌細胞中的表達強度。結果顯示雄激素可誘導耐比卡魯胺前列腺癌細胞肺耐藥蛋白(LRP)表達增強，這與蔣照輝等報道的結論一致。

作者：朱文勝譚毅楊松鄒飛陳勇張洋彭拓單位：重慶三峽醫藥高等?？茖W校附屬醫院泌尿外科