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1材料與方法

1．1細胞培養從液氮罐中取出凍存的PC3細胞，迅速放入預熱的37℃水浴鍋中，快速震蕩溶化，1000r•min－1離心5min后，將細胞接種于已配制好的含10％FBS和1％L－Gln的DMEM完全培養基中，置于37℃，5％的CO2培養箱中培養．每隔2～3d更換細胞培養液，待其長到鋪滿皿底80％時傳代．依據Friedenstein［11］提出的全骨髓貼壁培養法分離和純化大鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs）做為陰性對照組細胞，常規傳代培養．

1．2軟瓊脂克隆

1．2．1軟瓊脂儲備膠的制備下層膠制備：配制1．2％的低熔點瓊脂糖，高壓滅菌，待其溫度降至37℃左右后置于37℃水浴鍋備用．取1．5mL1．2％低熔點瓊脂糖加入已經配好的1．5mL2×DMEM培養基（含20％FBS＋1％Gln），混勻后倒入六孔板中制成軟瓊脂底板，置于冰袋上待其冷卻凝固后備用．上層膠制備：配制0．7％的低熔點瓊脂糖，高壓滅菌，待其溫度降至37℃左右后置于37℃水浴鍋備用，取1．5mL0．7％低熔點瓊脂糖加入已經配好的約含有1～3×103mL－1PC3細胞的等體積2×DMEM培養基中，混勻后倒入軟瓊脂底層上，制成雙瓊脂層，置于冰袋上待其冷卻凝固后置于培養箱中培養7～14d左右鏡檢，觀察軟瓊脂克隆團的形成情況．

1．2．2單細胞軟瓊脂克隆團的獲取軟瓊脂克隆團形成第14d置于倒置顯微鏡下觀察，標記并挑出較大克隆團后置于細胞培養皿中培養．第3d觀察有無貼壁細胞生長，若有則棄去含有瓊脂渣的培養基，加入新鮮培養基培養，每隔2～3d更換細胞培養液，待細胞鋪滿皿底80％～90％時傳代；若無貼壁細胞生長則棄去培養皿，重新挑取單克隆團細胞．

1．3乳鼠移植瘤動物模型的構建取對數生長期的實驗組細胞PC3和對照組細胞BMSCs，經胰蛋白酶消化后，DMEM完全培養基終止消化，1000r•min－1離心7min，棄上清，DMEM完全培養基重懸細胞，臺盼藍計數后，調整細胞濃度約為2×107mL－1．用1mL注射器吸取0．1mLPC3細胞懸液接種于實驗組乳鼠皮下，對照組乳鼠皮下注射0．1mLBMSCs細胞懸液．注射后每天定時觀察乳鼠皮下的成瘤情況，用游標卡尺測量皮下腫物的直徑，以大于0．5cm為成瘤成功．

1．4病理組織觀察和免疫組織化學檢測剝離乳鼠皮下產生的腫物，9％福爾馬林液固定，組織過夜脫水后，石蠟包埋切片．切片組織經過二甲苯和梯度酒精脫水脫蠟，蘇木精染色3～5min，1％HCl分色1～3s，碳酸鋰返藍2min，伊紅染色2min，酒精脫水，干燥后中性樹脂封片．在光學顯微鏡下觀察組織病理切片形態．免疫組織化學染色按照免疫組化二抗試劑盒說明書操作：石蠟切片烘烤30min后，二甲苯和梯度酒精脫水脫蠟，檸檬酸鹽緩沖液抗原修復5min，PBS沖洗3×3min，3％去離子水孵育15min，PBS沖洗3×3min，滴加試劑A（山羊血清）室溫孵育15min，傾去勿洗，滴加一抗（陰性對照組一抗用PBS代替），37℃孵育2h，PBS沖洗3×3min，滴加試劑B室溫孵育15min，PBS沖洗3×3min，滴加試劑C室溫孵育15min，PBS沖洗3×3min，DAB顯色，自來水沖洗，干燥，中性樹脂封片．光學顯微鏡下觀察抗體表達部位．

2結果與分析

2．1PC3軟瓊脂克隆團產生和單細胞克隆團形成PC3接種第7d時軟瓊脂上產生了較小的細胞克隆團（圖1：A），待其長到13d時，形成較大的細胞克隆團（圖1：B）．選取較大克隆團細胞在液體培養基中分離培養（圖1：C，D）后發現，這部分從軟瓊脂克隆團上挑出的單細胞比未經軟瓊脂克隆的細胞表現出更強的增殖能力。

2．2乳鼠皮下成瘤18只實驗組乳鼠皮下均有直徑大于0．5cm的腫物產生，6只對照組乳鼠皮下均無異物產生且生長狀態良好．肉眼觀察實驗組乳鼠發現：注射第2d后乳鼠腋下發紅腫脹，觸摸質軟；第3～4d乳鼠腋下發紅完全消失，腫脹部分逐漸變硬，觸摸可發現有黃豆粒大小可移動腫物存在（圖2：A）．第7d乳鼠皮下腫物逐漸增大，觸摸質硬（圖2：B）．第16d之后，部分乳鼠維持腫物大小不變，部分乳鼠腫物開始消退（圖2：C）．第21d之后，除3只乳鼠皮下存在極小腫物外（圖2：D），其余乳鼠腫物均消退．表明在初接種PC3細胞時乳鼠免疫系統發育不完善，腫瘤細胞能夠被宿主的免疫系統接受并逃離免疫系統的監控即具有免疫耐受性，使腫瘤在皮下發生并生長．接種16d及之后，有部分乳鼠皮下腫物開始消退，提示此時接種鼠的免疫系統已逐漸發育完全，能夠對接種的異質細胞進行免疫監控和殺滅．接種21d后，只有3只鼠皮下存在腫瘤，類似于部分腫瘤存在于人類非免疫缺陷人群中，其余鼠消退證明此時小鼠免疫功能已發育完全．

2．3病理組織變化和CD133表達觀察病理組織切片HE染色結果發現：腫物組織內有大片彌漫性分布、紊亂無章排列的腫瘤細胞存在，細胞形態大小不一，核大深染，可見明顯病理性不規則核分裂相，為中度不典型增生，病理學上診斷為腫瘤組織（圖3：A）．免疫組織化學染色結果顯示該腫瘤組織表達了前列腺癌干細胞特異性表面標志物分子CD133細胞膜和細胞漿均呈陽性（＋＋）（圖3：B）．

3討論

腫瘤的發生和發展是一個非常復雜的過程，在生物體內直接研究癌細胞的產生機理和細胞生物學特性受到很多因素的影響．因此，建立理想動物移植瘤模型對各種基礎研究和臨床研究都有非常重要的意義，但要求該模型的腫瘤發生部位、發病機制以及生物學特性等方面均要符合所研究的人源腫瘤．可移植腫瘤動物模型具有接種腫瘤細胞后實驗動物帶有同一腫瘤，個體差異較小、生長狀況和宿主反應一致，可以較為客觀的判斷腫瘤治療的療效等特點，在目前腫瘤模型研究中應用較為廣泛．腫瘤動物模型的移植主要有兩種［12］：同種移植和異種移植；同種移植是指模型動物間的移植，而異種移植是指任何人和裸鼠之間的移植．一般的鼠移植性實驗腫瘤為自發性或者誘發性腫瘤，這部分腫瘤經傳代后可保持其原有特性，從而成為移植性腫瘤．軟瓊脂克隆形成實驗（Softagarassay）是體外研究腫瘤的一項重要實驗，常用來檢測轉化細胞和腫瘤細胞［13］．Li等人的研究發現［14］：通過軟瓊脂克隆形成實驗篩選出的腫瘤細胞在動物成瘤實驗中具有強的成瘤和轉移能力，并且具有腫瘤干細胞特性［15］．因此本實驗利用目前研究較為成熟的前列腺癌細胞PC3中存在極少部分具有致瘤性的CD133＋前列腺癌干細胞［16－18］做為模型動物的接種細胞系，通過軟瓊脂克隆形成實驗篩選出此類細胞中具有強克隆集落形成能力和增殖能力的腫瘤細胞接種于乳鼠皮下，提高致瘤成功率．實驗結果顯示：接種PC3細胞乳鼠成瘤率為100％，在接種2～15d移植瘤穩定而快速增長，移植瘤經剝離后病理切片HE染色觀察有大片彌漫性分布的癌細胞，且有典型的病理學不規則核分裂相存在，病理學上診斷為腫瘤組織，免疫組織化學染色后前列腺癌干細胞表面標志物CD133表達水平呈強陽性，表明本實驗成功建立了乳鼠移植瘤模型．綜上所述，本實驗利用出生2d乳鼠成功構建了動物移植瘤模型，由于剛出生乳鼠的免疫細胞在個體發育的早期對抗原易形成耐受性，因此易于移植瘤的成活和生長，同時正常的免疫機體環境也模擬了臨床上腫瘤發生的微環境．此外，乳鼠移植瘤模型能夠體現宿主免疫監控移植瘤這一過程，模擬臨床腫瘤發生．且這一模型具有成瘤率高、易于存活、生長條件簡單等特點，是一種比較理想的移植瘤動物模型。

作者：曾家豫張虹袁紅霞牛童廖世奇單位：西北師范大學生命科學學院甘肅省醫學科學研究院分子生物中心