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1材料與方法

1．1小鼠DC細胞分離培養［6－7］斷頸處死小鼠，75％酒精中浸泡5min，超凈臺中無菌取出小鼠的股骨、脛骨，剪去兩端，用1mL注射器吸buffer刺入骨髓腔，反復沖洗直至骨發白，200目濾網沖過濾，收集細胞懸液，離心（300g，10min），加入紅細胞裂解液，離心去上清，buffer清洗沉淀后再次離心。用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養基重懸細胞，接種于24孔板（1×106／mL），加入細胞因子GM-CSF50ng／mL、IL-425ng／mL，37℃，5％CO2，進行培養。48h后，棄培養基，PBS清洗1遍，加入新的培養基。之后隔天半量換液。第8天加入LPS繼續培養24h，離心收集的懸浮細胞即為DC細胞。

1．2CT26．WT細胞與全T細胞共培養37℃，5％CO2培養的CT26．WT細胞待密度超過80％，胰酶消化，計數待用。T細胞∶CT26．WT（10∶1）進行混合培養，48h后做實驗研究。

1．3DC細胞與T細胞共培養腹腔注射第1、15天的DC細胞與對應的T細胞，調至適當濃度至1×106個／mL（DC∶T＝1∶10），加入96孔板，100μL／孔，混合培養48h。每組設5個復孔，同時設單獨DC細胞孔、單獨T細胞孔。刺激能力的計算：（混合孔－單獨DC細胞孔）／單獨T細胞孔。

1．4B7H4的檢測取新鮮的人結直腸癌組織及配對的正常腸上皮組織8對；CT26．WT細胞腹腔注射第15天的BALB／c小鼠，待腹腔成瘤后，取腫瘤組織及配對的正常腸組織1對，IHC檢測B7H4的表達；腹腔注射的第0、1、2周，取小鼠腸組織及腫瘤組織，WesternBlot檢測組織蛋白B7H4的表達。

1．5統計學方法所有數據采用SPSS17．0統計軟件進行單因素方差分析、t檢驗等。P＜0．05為差異有統計學意義。

2結果

2．1DC細胞在鏡下的細胞形態第8天可見多數細胞呈集落樣生長。

2．2腹腔注射不同時間段的全T細胞對CT26．WT的殺傷效應腹腔注射不同時間段（1、3、5、7、9、11、15d）全T細胞與CT26．WT（10：1）混合共培養48h后，CCK8結果示第7天，活細胞數開始略上升，第15天最高（第1天：OD＝1．24400±0．25146；第15天：OD＝3．05767±0．86557；P＝0．000，差異有統計學意義，圖2）；第1、15天的共培養體系進行細胞凋亡檢測：第15天細胞凋亡率降低（第1天：CT26凋亡率8．667±0．4055；第15天：CT26凋亡率3．633±0．4910；P＝0．001，差異有統計學意義）。

2．3流式細胞術檢測DC細胞表型腹腔注射的第1、15天，DC細胞表面分子MHC-Ⅱ陽性率（79．000±1．9348vs51．000±2．9180）比較，差異有統計學意義。

2．4DC細胞表面分子ICAM-1的表達搜集腹腔注射不同時間段（0d－正常小鼠，1、3、5、7、9、11、15d）的DC細胞，WesternBlot檢測ICAM-1的表達。第9天其表達開始下降，第15天最低。

2．5IHC檢測B7H4在正常腸上皮（N）和癌組織（T）中的表達WesternBlot檢測腹腔注射不同時間段小鼠組織B7H4的表達9對組織（8對人來源的，1對鼠來源的）均顯示B7H4在癌組織中表達增高（圖5）。腹腔注射第0、1、2周，正常腸上皮組織（第0周）B7H4表達很微弱，第1、2周，腹腔內已有腫瘤形成，腫瘤組織B7H4表達上升。2．6腹腔注射1、15天，DC細胞刺激T細胞增殖能力的比較第1天：2．77±0．017214；第15天：2．33±0．016836；P＝0．000，差異有統計學意義。

3討論

腫瘤免疫機制是一個復雜的網絡系統，已有研究發現：B7H4可以抑制T細胞的激活和增殖；TGF-β可以誘導免疫抑制［12］；結直腸癌來源的成纖維細胞可以抑制自然殺傷細胞的功能等［13］。1970年，Bretscher和Cohn已證實“協同刺激信號”決定著T細胞免疫的方向，在宿主抵抗外來入侵時至關重要，而T細胞活化的第一信號就來源于APC所提呈的抗原。DC細胞是1973年由Steinman等［14］首先發現的，是目前所知抗原提呈能力最強的APC，而T細胞活化則需要兩個信號：第1信號來自DC等細胞提呈的抗原，第2信號則為共刺激分子包括B7／CD28、ICAM-1／LFA-1、LFA-3／CD2等，缺乏任一信號T細胞都不能有效地發揮處理腫瘤細胞的能力。

本研究將CT26．WT腹腔注射入BALB／c小鼠體內，動態觀察其對宿主產生的影響，利用該細胞株的高侵襲性，短時間內構建腫瘤與免疫的模型。利用T細胞與腫瘤細胞共培養，發現T細胞的殺傷能力下降，其后對這一結果做進一步研究，著重觀察抗原遞呈的改變。發現隨著腹腔注射時間的延長，抗原提呈細胞DC細胞表面分子MHC-Ⅱ的表達降低；LFA-1／ICAM-1參與T細胞的活化、增殖、分化及歸巢等多種生理過程，WesternBlot檢測發現DC細胞表面分子ICAM-1表達也下降。最終使T細胞殺傷CT26．WT細胞的能力下降。另外，腫瘤細胞表面分子發生改變也是腫瘤逃逸的原因，本研究取新鮮的結直腸癌組織標本，以及腹腔注射第1、2周的小鼠結腸癌組織，免疫組化及WesternBlot檢測均發現腫瘤高表達B7H4，這又進一步抑制了T細胞的活化。綜合以上對BALB／c小鼠體內外實驗的初步探究，提醒我們在關注腫瘤本身的同時，也應將眼光聚焦于與腫瘤生存密不可少的免疫環境。研究表明用腫瘤細胞mRNA致敏DC細胞可以產生特異性抗腫瘤反應，了解高表達B7H4的腫瘤細胞與DC細胞之間的微觀分子機制，明確DC細胞與腫瘤的相關信號轉導途徑的關系，將對腫瘤的治療與預防有著重要的意義。

作者：馮娜周娜鄧永鍵單位：南方醫科大學基礎醫學院病理學系