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1材料與方法

1．1實驗分組根據MTT檢測結果，后續研究采用50和100μmol•L－1處理組進行實驗。按照橙皮素作用濃度不同將細胞分為3組：DMSO對照組、50和100μmol•L－1橙皮素處理組；DMSO對照組中用DMSO代替橙皮素，其體積分數不超過0．2mL•L－1。各組細胞置于37℃、5％CO2環境中培養至一定時間后，進行相關指標檢測。

1．2流式細胞術檢測細胞凋亡和細胞周期每組收集1×106個細胞，用冰浴預冷的PBS洗3次，再用冰浴預冷的70％乙醇固定，4℃過夜。2000r•min－1離心3～5min，沉淀細胞。每管細胞樣品中加入0．5mL碘化丙啶染色液，緩慢并充分重懸細胞沉淀，37℃避光溫浴30min，經流式細胞儀檢測，平行實驗重復3次。實驗結果以細胞凋亡百分率和細胞周期各時相百分率表示。

1．3熒光定量PCR檢測采用Trizol法提取各組細胞總RNA，利用紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度，以A260／A280＝1．8～2．0為宜。以經反轉錄獲得的cDNA作為模板，采用SYBRGreen熒光染料，按照試劑盒說明進行定量PCR。定量PCR反應條件為：變性，95℃、30s；PCR反應，95℃、5s，60℃、20s，共40個循環；95℃、5s，60℃、1min。然后按照每15s上升0．3℃至95℃后，保持15s。分別收集熒光信號，進行熔解曲線分析。經定量PCR后，分別獲得各組細胞中GAPDH的Ct值和目的基因的Ct值，Ct是熱循環儀檢測到反應體系中熒光信號的強度值，采用相對定量PCR2－ΔΔCt值法計算各目的基因相對于GAPDH基因的表達量。ΔΔCt＝（實驗組目的基因Ct－實驗組管家基因Ct）－（對照組目的基因Ct－對照組管家基因Ct）。平行實驗重復3次。

1．4免疫印跡分析收集各組細胞，用蛋白裂解液裂解細胞以獲取各組細胞總蛋白，并用蛋白濃度測定試劑盒測定各組總蛋白濃度，以保證上樣時各組蛋白水平一致。蛋白變性后經SDS－PAGE分離，再轉移至PVDF膜上，用脫脂奶粉封閉，加兔抗人Notch1（1∶1000）和Hes－1（1∶1000）以及GAPDH（1∶1000），4℃過夜。加入HRP標記的羊抗兔二抗，室溫搖動1h。用ECL顯色，X線曝光顯影。平行實驗重復3次。采用Image軟件分析免疫印跡結果中各條帶的灰度，將各組GAPDH條帶灰度值標準化，并以DMSO對照組為1進行標準化，分析各目的蛋白的表達變化。1．8統計學分析應用SPSS10．0統計軟件對數據進行分析處理。各組細胞增殖抑制率、細胞凋亡率、細胞周期百分率和基因相對表達水平均以x±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析。

2結果

2．1各組Tca8113細胞增殖抑制率與DMSO對照組比較，125μmol•L－1橙皮素處理組24、48和72hTca8113細胞增殖抑制率明顯升高（7．88％±1．90％、26．28％±2．20％和47．05％±1．90％）（P＜0．05）；在橙皮素處理72h后，25、50、75、100和125μmol•L－1橙皮素處理組細胞增殖抑制率分別為（6．14±1．20）％、（28．69±2．10）％、（28．33±2．60）％、（45．26±3．00）％和（47．05±1．90）％，橙皮素對Tca8113細胞的增殖抑制作用呈現時間劑量依賴性。且在同一監測點（24、48和72h），50和75μmol•L－1橙皮素處理組細胞增殖抑制率［（4．89±1．40）％vs（5．77±1．80）％、（17．91±2．60）％vs（19．27±2．30）％、（28．69±2．10）％vs（28．33±2．60）％］組間比較差異無統計學意義（P＞0．05），100和125μmol•L－1橙皮素處理組細胞增殖抑制率［（6．96±2．00）％vs（7．88±1．90）％、（24．21±2．70）％vs（26．28±2．20）％、（45．26±3．00）％vs（47．05±1．90）％］比較差異亦無統計學意義（P＞0．05），故選擇50和100μmol•L－12個濃度進行后續實驗。

2．2各組細胞凋亡率和細胞周期百分率48和72h細胞凋亡檢測結果顯示：50和100μmol•L－1橙皮素處理組的細胞凋亡百分率分別為（15．9±1．8）％、（23．4±1．7％）和（27．4±1．6）％、（35．1±1．9）％，均高于同監測點DMSO對照組（1．4％±0．3％，2．9％±0．5％），差異有統計學意義（P＜0．05）；且100μmol•L－1橙皮素處理組細胞凋亡百分率高于同監測點50μmol•L－1橙皮素處理組（P＜0．05）。見圖1。細胞周期結果顯示：橙皮素作用于Tca8113細胞后，G0／G1期細胞百分率明顯升高，S期細胞百分率明顯下降（P＜0．05）。見表1。

2．3橙皮素作用下Notch1和Hes－1mRNA表達水平熒光定量PCR結果顯示：與DMSO對照組比較，100μmol•L－1橙皮素處理組細胞中Notch1（2．06±0．11）和Hes－1（2．61±0．11）的mRNA相對表達水平均升高（P＜0．05）。見表2。2．4橙皮素作用下Notch1和Hes－1蛋白表達免疫印跡檢測結果顯示：與DMSO對照組比較，100μmol•L－1橙皮素處理組細胞中Notch1蛋白及其活化形式Hes－1蛋白表達均上調。見圖2。

3討論

橙皮素是一種廣泛存在于蕓香科柑橘屬植物中的黃烷酮類化合物［6］，除具有抗腫瘤和免疫調節作用外，還因其易于從食物中獲取，且直接作用于口腔等優點在舌癌治療中顯現出較大優勢，而對其抑癌作用機制的探討將有助于舌癌防治的研究。本研究結果顯示：橙皮素能夠抑制舌癌細胞的增殖，并且抑制作用呈現時間－劑量依賴性。不同濃度橙皮素作用后，Tca8113細胞發生明顯凋亡以及細胞周期G0／G1期阻滯。這些結果說明橙皮素是通過誘導細胞凋亡和阻礙細胞周期進程發揮對舌癌細胞生長的抑制作用。這一結果與Alshatwi等［7］在研究橙皮素對宮頸癌細胞作用時的結果一致。Notch信號通路是一條對多種組織和器官發育起重要調控作用的信號傳導系統［8］。研究表明：作為哺乳動物Notch受體之一的Notch1在不同腫瘤甚至同一腫瘤的不同發展階段具有不同的、甚至截然相反的作用，Notch1發揮“促癌”還是“抑癌”作用，與細胞所處環境有密切關聯，干預Notch1活化對腫瘤發生發展及轉歸具有重要意義。本課題組以前研究［11］顯示：Notch1信號通路的活化能夠抑制舌癌細胞增殖和導致細胞周期發生G0／G1期阻滯。本文作者提出假設：橙皮素對Tca8113細胞產生的這些作用可能與Notch1信號激活有關聯。為了驗證這一假設，本文作者檢測了橙皮素作用前后Tca8113細胞中Notch1基因及其活化形式Hes－1的表達情況，結果發現：橙皮素作用后，Notch1和Hes－1mRNA和蛋白的表達水平均升高，Notch1呈現激活狀態。而Notch1的活化對細胞凋亡和細胞周期會產生重要影響。因為Notch1不僅可以通過激活JNK和p53誘導細胞凋亡［12－13］，而且活化的Notch1還能夠通過改變細胞周期蛋白D1、Rb和p16等G1期調節劑而導致細胞周期出現G1期阻滯［14－15］。綜上所述，橙皮素抑制舌癌細胞增殖的作用機制可能與激活Notch1信號傳導、進而誘導細胞凋亡和細胞周期G0／G1期停滯有關聯。

作者：劉治慧楊巍單位：臺州學院附屬市立醫院口腔科北華大學醫學檢驗學院免疫學教研室臺州學院醫學院檢驗系