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摘要：

［目的］研究二去水衛(wèi)矛醇對人卵巢癌細胞A2780和SKOV3增殖的抑制作用。［方法］采用噻唑藍（MTT）比色法和CCK－8（cellcountingkit－8）法檢測不同濃度DAG對人卵巢癌細胞A2780和SKOV3的體外抑制作用，觀察DAG的半數(shù)抑制濃度。［結果］MTT法檢測結果顯示，DAG對人卵巢癌細胞A2780、SKOV3作用72h后半數(shù)抑制濃度（72h－IC50）分別為19．97μg／ml、22．57μg／ml；而CCK－8法檢測結果顯示，DAG對人卵巢癌細胞A2780、SKOV3作用72h后72h－IC50分別為15．15μg／ml、16．15μg／ml。顯微鏡下可見DAG72h作用后細胞圓縮、胞質(zhì)濃縮、胞漿內(nèi)顆粒集中邊緣化甚至細胞溶解等損傷現(xiàn)象。［結論］DAG在體外對人卵巢癌細胞A2780和SKOV3均有抑制生長作用。

關鍵詞：

二去水衛(wèi)矛醇；人卵巢癌細胞；噻唑藍試驗；CCK－8法；半數(shù)抑制濃度

二去水衛(wèi)矛醇是以從衛(wèi)矛科植物蜜花美登木中分離出的衛(wèi)矛醇［1］為原料，經(jīng)溴化、消除反應而制得的1，6－二溴衛(wèi)矛醇（1，6－dibromidulcitol）的雙環(huán)氧化物，是新型的植物生物堿類抗腫瘤藥，它與烷化劑形成交叉耐藥，結構上可歸為烷化劑類，為廣譜抗腫瘤藥物，具有毒性小、易溶于水、抗腫瘤活性高等優(yōu)點。早期臨床試驗表明，DAG對慢性粒細胞白血病、肺癌、原發(fā)性腦瘤、人胃癌細胞、人鼻咽癌細胞、人肺癌細胞、腎上腺腫瘤、膀胱癌、胃腸道腫瘤實體瘤等均有抑制作用［2－7］。另外，還有研究表明DAG是周期非特異性藥物，它可以與某些周期特異性藥產(chǎn)生協(xié)同作用［8］。而DAG對人卵巢癌抑制作用及分子機制的研究在國內(nèi)外尚未見詳盡報道。為此，本實驗通過噻唑藍（MTT）比色法和CCK－8法檢測DAG對人卵巢癌的體外抗腫瘤活性，為擴大其抗瘤譜及進一步進行結構改造、分子機制研究提供依據(jù)。

1材料與方法

1．1藥物與細胞株二去水衛(wèi)矛醇由廣西梧州制藥（集團）股份有限公司提供，臨用前用完全培養(yǎng)基液配成所需濃度；RPMI1640、胎牛血清（FBS）、0．25％胰蛋白酶溶液均購于賽默飛世爾生物化學制品（北京）有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS，0．01mol／L）是福州邁新生物技術開發(fā)有限公司產(chǎn)品；青鏈霉素混合液（100U／ml）和噻唑藍（MTT）均是北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；CCK－8溶液是上海尚寶科技有限公司產(chǎn)品；人卵巢癌細胞A2780和SKOV3購自中科院上海細胞庫。

1．2主要儀器設備CO2培養(yǎng)箱；酶標儀；倒置顯微鏡（重慶光學儀器廠出品）。

1．3細胞的培養(yǎng)先配好含10％胎牛血清和青鏈霉素混合液（終濃度為青霉素100IU／ml，鏈霉素100μg／ml）的RPMI1640完全培養(yǎng)液，然后用此完全培養(yǎng)液于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人卵巢癌細胞A2780和SKOV3，細胞貼壁生長，隔天換液，待細胞長至覆蓋瓶底的80％左右時，用0．25％胰蛋白酶溶液消化傳代。取狀態(tài)良好的長至對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)細胞增殖抑制實驗。

1．4MTT試驗方法收集對數(shù)生長期的A2780和SKOV3細胞，調(diào)整細胞密度，以每孔100μl、5×103個細胞接種于96孔板里，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，以細胞培養(yǎng)基為空白對照，A2780、SKOV3細胞的其他組分別加入6μg／ml、12μg／ml、24μg／ml、48μg／ml、96μg／mlDAG完全培養(yǎng)液100μl，同時每組設5個復孔，處理完后置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72h后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，并于每孔中加入20μl的MTT溶液，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150μlDMSO溶液顯色，振蕩10min，使孔內(nèi)溶液顏色均勻，于570nm波長酶標儀測定吸光度值（OD）。實驗重復3次，取平均值為最終結果。按下式計算細胞增殖抑制率：細胞增殖抑制率＝1－實驗組平均OD值／空白對照組平均OD值×100％，計算細胞生長抑制達50％的DAG濃度，以72h－IC50表示。

1．5CCK－8試驗方法細胞處理情況與MTT法相似，待培養(yǎng)細胞，給藥處理72h后，同樣于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，將每孔培養(yǎng)液混合均勻，吸出100μl棄去，并于每孔中加入10μl的CCK－8溶液，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待1．5h后觀察顯色情況，于450nm波長酶標儀測定吸光度值（OD）。實驗重復3次，取平均值為最終結果，計算細胞增殖抑制率。

2結果與分析

2．1兩種方法測定結果MTT法測定不同濃度DAG對A2780及SKOV3細胞作用72h后的OD值及細胞增殖抑制率見表1，CCK－8法測定不同濃度DAG對A2780及SKOV3細胞作用72h后的OD值及細胞增殖抑制率見表2。通過SPSS19．0軟件計算DAG對兩種細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）值。表1、表2結果看出，經(jīng)不同濃度DAG作用72h后，上述實驗組的OD值與空白對照組相比均呈下降趨勢，且有明顯的濃度－效應關系。說明DAG對以上兩株人卵巢癌細胞均有抑制生長作用。兩種測定方法的結果顯示，CCK－8法的靈敏度和準確度較高，且重復性優(yōu)于MTT法。

2．2細胞形態(tài)觀察結果DAG作用于A2780和SKOV3細胞72h后，在倒置顯微鏡下觀察，各實驗組細胞均不同程度出現(xiàn)貼壁能力減弱、細胞圓縮、胞質(zhì)濃縮、胞漿內(nèi)顆粒集中邊緣化甚至細胞溶解等損傷現(xiàn)象，而空白對照組細胞均生長良好，細胞形態(tài)完整，胞質(zhì)透亮。

3結論

本文初步探討了DAG對人卵巢癌細胞的體外抑制作用，結果表明，DAG對A2780、SKOV3兩株人卵巢癌細胞均有抑制生長作用，且具有明顯的濃度－效應關系。但DAG誘導人卵巢癌細胞凋亡所發(fā)生的基因、蛋白表達譜變化，體內(nèi)抑制人卵巢癌效果等有待于下一步深入研究，以便于發(fā)現(xiàn)新的作用靶點，對其進行相應的結構改造，開發(fā)抗腫瘤靶向制劑。

作者：周瑩 劉華鋼 蘇桂玉 彭曉麗 單位：廣西醫(yī)科大學 廣西中醫(yī)藥大學