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摘要：

目的觀察伯氏瘧原蟲(chóng)（Pb）ANKA株哌喹抗性系（PQR）感染小鼠組織病理學(xué)變化特征，比較與哌喹敏感系（PQS）的差異，探討其抗性機(jī)制。方法實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為A（PQS）、B（PQR）及C（正常對(duì)照，NC）三組，取肝、脾、腦及腎組織，10%福爾馬林固定后石蠟包埋，4μm切片，蘇木精一伊紅（Haematoxylin-eosin,HE）及吉姆薩（Giemsa）染色，鏡下觀察其組織病理學(xué)改變。結(jié)果與PQS組比較，PQR組瘧原蟲(chóng)感染紅細(xì)胞（pRBC）及瘧色素（HZ）在各器官組織中出現(xiàn)晚，增殖緩慢，數(shù)量明顯偏少，在17d增至峰值時(shí)仍明顯少于PQS組6d時(shí)，22d時(shí)開(kāi)始下降。各組織的炎性病變隨感染天數(shù)的延長(zhǎng)而變化：早期較輕，呈漸進(jìn)性發(fā)展，17d時(shí)達(dá)到高峰，22d時(shí)炎癥減輕，組織損傷呈恢復(fù)趨勢(shì)，其兩組肝、脾組織中炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)程度在6d時(shí)未見(jiàn)明顯不同。腦組織的炎性反應(yīng)、瘧原蟲(chóng)浸潤(rùn)及組織損傷程度均顯著輕于PQS組。結(jié)論P(yáng)QR系的毒力下降、致病力降低表象的組織病理學(xué)特征為：肝、脾、腦和腎組織中pRBC及HZ浸潤(rùn)量明顯偏低，炎性反應(yīng)、原蟲(chóng)數(shù)量的變化呈逐漸增加、降低、趨向恢復(fù)的動(dòng)態(tài)過(guò)程，未見(jiàn)明顯的腦型瘧的組織學(xué)變化。

關(guān)鍵詞：

伯氏瘧原蟲(chóng)；哌喹抗性；瘧色素；組織病理學(xué)；蘇木精-伊紅染色法

磷酸哌喹（Piperaquinephosphate,PQ）是瘧疾防治的主要藥物，單用容易產(chǎn)生抗藥性，世界衛(wèi)生組織提出與青蒿素的衍生物雙氫青蒿素配伍制成的復(fù)方藥物-科泰復(fù)，是目前流行區(qū)抗瘧的主要一線藥物[1]。盡管復(fù)方藥物的應(yīng)用已有效延緩了瘧原蟲(chóng)對(duì)抗瘧藥抗性的產(chǎn)生，但對(duì)瘧原蟲(chóng)抗性機(jī)制研究依然迫在眉睫，PQ的抗性機(jī)制亟待闡明。在前期的PQ抗性機(jī)制研究中，課題組通過(guò)對(duì)伯氏瘧原蟲(chóng)（Plasmodiumberghei，Pb）ANKA株哌喹敏感株（PQsensitive,PQS）感染小鼠采用PQ連續(xù)加壓的方法，建立了Pb抗哌喹（PQresistant，PQR）系感染小鼠模型[2]。觀察發(fā)現(xiàn)，隨著抗性的產(chǎn)生，PQR模型小鼠瘧原蟲(chóng)毒力明顯減弱，致病力下降，對(duì)小鼠影響由致死性變?yōu)樯嫫陲@著延長(zhǎng)甚至存活[2]；感染小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖水平、NO水平和IFN-γ含量均顯著高于PbANKA株P(guān)QS系感染小鼠，并可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一定保護(hù)性免疫反應(yīng)[3]；進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，感染早期6d時(shí)脾細(xì)胞中TNF-a及INF-γ細(xì)胞因子分泌細(xì)胞數(shù)量在PQR組明顯高于PQS組[4]。PbANKA株對(duì)PQ產(chǎn)生抗性后對(duì)小鼠主要組織器官所造成的影響及其組織病理學(xué)特征如何？據(jù)研究資料報(bào)道，惡性瘧原蟲(chóng)感染可造成嚴(yán)重的組織器官病理?yè)p害及功能障礙或?qū)е履X型瘧的發(fā)生，是瘧疾病人死亡的重要原因之一[5-7]。由此推測(cè)，PQR系感染小鼠組織病理學(xué)損傷與致死性PQS系感染小鼠相比可能不同。本文利用該鼠瘧模型，通過(guò)常規(guī)蘇木精—伊紅（Hematoxylin-Eosin，HE）染色法并輔以對(duì)組織中的瘧原蟲(chóng)有良好染色效果的優(yōu)化吉姆薩（Giemsa）組織染色法[8]，對(duì)PQR組以及PQS組感染小鼠的肝、脾、腦和腎組織進(jìn)行了病理組織形態(tài)學(xué)觀察，旨在通過(guò)比較PQR與PQS感染小鼠組織病理學(xué)變化特點(diǎn)及差異，從組織學(xué)的角度探討瘧原蟲(chóng)對(duì)PQ的抗性相關(guān)機(jī)制，為PQR抗性相關(guān)感染免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的闡明，提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1PbPQS和PbPQR

PbPQS系由海南省熱帶病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，以低溫冷凍和鼠間血傳交替保種；PbPQR系由海南醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心建立及保種[2]。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

80只雄性瑞士種昆明遠(yuǎn)交系小鼠購(gòu)自廣州中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，6~8周齡，體重為（25±2）g。隨機(jī)分為3組，即A組（PQS組）10只、B組（PQR組）和C組（正常對(duì)照組，NC）各35只。1.1.3試劑吉姆薩（Giemsa）粉劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司，蘇木素（Hematoxylin）、伊紅（Eosin）購(gòu)自阿拉丁試劑公司。1.2方法1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染A、B組分別腹腔感染PQS系和PQR系1×107個(gè)紅內(nèi)期原蟲(chóng)（200μL血），C組腹腔注射200μL生理鹽水。A組小鼠在感染后3、6d,B、C組小鼠在感染后3，6，9，12，15，17及22d脫頸處死，取肝、脾、腦和腎組織制片。

1.2.2染液配制

HE染液采用改良Carazzi蘇木素染液配制法配制[9]。Giemsa染液原液根據(jù)文獻(xiàn)[10]配制后，用pH6.8的磷酸鹽緩沖液30倍稀釋后做為組織切片染色液[8]。

1.2.3HE染色方法

小鼠肝、脾、腦及腎組織經(jīng)石蠟包埋后4μm切片，60℃烤箱30min，二甲苯中脫蠟，梯度乙醇水化，蘇木素染液中5min，水沖洗，1%鹽酸乙醇中分化3s，水沖洗，pH7.2PBS中返藍(lán)30s，水沖洗，1%伊紅中染色20s，水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯中透明，中性樹(shù)膠封固后鏡檢。

1.2.4Giemsa染色方法

組織切片的Giemsa染色脫蠟、水化過(guò)程與HE染色同，其染色為30倍稀釋染液室溫染色5min，水沖洗，水溶性封片劑封固后鏡檢。1.2.5分析方法采用半定量的方法對(duì)pRBC、HZ及炎性細(xì)胞的組織中浸潤(rùn)程度進(jìn)行分析判斷，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選擇5個(gè)高倍（×400）及油鏡（×1000）視野觀察分析，每組取5個(gè)標(biāo)本的均數(shù)作為該組的半定量結(jié)果。

2結(jié)果

2.1感染小鼠一般情況PQS組

小鼠感染6d時(shí)均出現(xiàn)體重下降，精神萎靡、縮頭不動(dòng)，皮毛松弛、尾巴發(fā)青觸及無(wú)熱度、對(duì)外界刺激反應(yīng)下降等瀕死癥狀；PQR組小鼠感染6d未見(jiàn)明顯變化，僅個(gè)別鼠在感染17d后出現(xiàn)上述癥狀。

2.2正常對(duì)照組組織HE及Giemsa染色鏡檢正常對(duì)照小鼠（C組）肝、脾、腦及腎組織光學(xué)顯微鏡下結(jié)構(gòu)正常，組織細(xì)胞輪廓清晰完整，見(jiàn)圖1A、圖2A、圖3A、圖4A。

2.3PQS和PQR組肝臟組織HE及Giemsa染色鏡檢PQS組

3d時(shí)可見(jiàn)肝竇輕度充血，肝細(xì)胞水腫，局部呈顆粒或氣球樣變性，肝竇及匯管區(qū)可見(jiàn)明顯的中性、淋巴、單核等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，個(gè)別成團(tuán)分布，枯否氏細(xì)胞增生，可見(jiàn)個(gè)別位于紅細(xì)胞內(nèi)的瘧原蟲(chóng)（ParasitisedRedBloodCell，pRBC）及瘧色素（MalariaPigmentHemozoin，HZ）顆粒。6d時(shí)肝細(xì)胞變性、肝竇充血加重，以淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞大量增加，肝竇內(nèi)可見(jiàn)大量的pRBC及呈點(diǎn)狀或團(tuán)塊狀分布的HZ，枯否氏細(xì)胞數(shù)量明顯增多，體積增大，大量細(xì)胞胞漿內(nèi)吞噬有瘧原蟲(chóng)、大小不等的HZ顆粒及紅細(xì)胞碎片；PQR組肝竇及匯管區(qū)的中性、淋巴、單核以及枯否氏細(xì)胞浸潤(rùn)從3d時(shí)開(kāi)始逐漸增加，感染第6、9d時(shí)，炎性細(xì)胞以淋巴及單核細(xì)胞增加為主，少量中性粒細(xì)胞，偶見(jiàn)個(gè)別pRBC；9d開(kāi)始可見(jiàn)局部肝組織充血，并逐漸加重，個(gè)別肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松，體積增大，水腫變性；12d時(shí)其匯管區(qū)及肝小葉邊緣區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)更為明顯，單核細(xì)胞比例進(jìn)一步增加，個(gè)別樣本的部分肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，pRBC或瘧原蟲(chóng)及HZ增加，部分聚集成團(tuán)，枯否氏細(xì)胞對(duì)其吞噬活躍；17d時(shí)以上變化達(dá)到高峰，22d時(shí)炎性反應(yīng)、pRBC及HZ明顯降低，浸潤(rùn)細(xì)胞以單核細(xì)胞為主,見(jiàn)圖1、表1。

2.4PQS和PQR組脾臟組織HE及Giemsa染色鏡檢PQS組

3d時(shí)鏡下可見(jiàn)白髓增大，淋巴細(xì)胞增加，脾竇內(nèi)可見(jiàn)少量pRBC及HZ顆粒。6d時(shí)白髓繼續(xù)增大，部分紅、白髓界限不清，可見(jiàn)大量pRBC、HZ及紅細(xì)胞碎片，HZ呈顆粒狀或成團(tuán)分布，巨噬細(xì)胞增多，內(nèi)見(jiàn)吞噬的瘧原蟲(chóng)、HZ與紅細(xì)胞碎片。PQR組3d鏡下可見(jiàn)個(gè)別脾臟白髓增大，其他未見(jiàn)明顯變化，6d時(shí)可見(jiàn)個(gè)別pRBC，巨噬細(xì)胞增加，9d時(shí)脾臟充血嚴(yán)重，個(gè)別紅、白髓界限不清，巨噬細(xì)胞大量增加，體積增大，胞體內(nèi)可見(jiàn)吞噬的瘧原蟲(chóng)、HZ和紅細(xì)胞碎片，12d時(shí)pRBC及HZ進(jìn)一步增加，15d始可見(jiàn)網(wǎng)狀細(xì)胞逐漸增加，以上的變化除網(wǎng)狀細(xì)胞外至17d時(shí)達(dá)到峰值，22d時(shí)脾臟的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，pRBC及HZ明顯減少，網(wǎng)狀細(xì)胞未見(jiàn)下降,見(jiàn)圖2、表1。

2.5PQS和PQR組腦組織HE及Giemsa染色鏡檢PQS組

3d時(shí)鏡下可見(jiàn)軟腦膜下及皮質(zhì)組織內(nèi)毛細(xì)血管充血，偶見(jiàn)pRBC。6d時(shí)充血進(jìn)一步加重，pRBC及HZ浸潤(rùn)增加，毛細(xì)血管及小血管內(nèi)pRBC及不含原蟲(chóng)的紅細(xì)胞聚集，并可見(jiàn)與血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附，局部腦組織可見(jiàn)小出血點(diǎn)，多量單核、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。PQR組3、6d未見(jiàn)明顯變化，9d時(shí)可見(jiàn)局部腦組織結(jié)構(gòu)疏松水腫，毛細(xì)血管充血，少數(shù)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，偶見(jiàn)pRBC；炎性細(xì)胞在17d時(shí)達(dá)到最高，并從早期以淋巴細(xì)胞為主轉(zhuǎn)為以單核細(xì)胞為主，可見(jiàn)個(gè)別瘧原蟲(chóng)；22d時(shí)水腫減輕，炎性細(xì)胞明顯減少，偶見(jiàn)個(gè)別瘧原蟲(chóng),見(jiàn)圖3和表1。

2.6PQS和PQR組腎臟組織HE及Giemsa染色鏡檢PQS組

3d局部組織腎小球及腎間質(zhì)內(nèi)毛細(xì)血管充血擴(kuò)張，可見(jiàn)個(gè)別pRBC。6d時(shí)充血加重，部分腎組織極度充血，腎小管細(xì)胞水腫，腎小管管腔變小，部分樣本大片腎臟組織結(jié)構(gòu)破壞及腎小管細(xì)胞壞死，腎小球、腎小管及間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)明顯的淋巴、單核-巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)及大量pRBC及HZ。PQR組鏡下3d未見(jiàn)明顯變化，6d時(shí)可見(jiàn)個(gè)別炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，隨后逐漸增加，12d時(shí)可見(jiàn)個(gè)別pRBC及HZ，局部組織充血，至17d時(shí)充血更為嚴(yán)重，淋巴、單核-巨噬細(xì)胞、pRBC及HZ增至峰值，并可見(jiàn)部分腎小球擴(kuò)大，22d時(shí)腎組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，充血明顯減輕或基本消失，pRBC及HZ浸潤(rùn)亦明顯下降，見(jiàn)圖4、表1。

3討論

PbANKAPQR小鼠顯著的生物學(xué)特征是病變癥狀輕，原蟲(chóng)感染率低，存活時(shí)間長(zhǎng)甚至可清除蟲(chóng)體存活[3-4]。與PQS感染小鼠比較，PQR組在感染6d時(shí)未出現(xiàn)類(lèi)似典型的腦型瘧癥狀及體征，其組織病理檢查結(jié)果顯示腦組織的炎性反應(yīng)、pRBC浸潤(rùn)及組織損傷程度明顯輕于PQS組，腎組織亦顯示相似的組織病理變化趨勢(shì)，肝、脾組織在感染6d時(shí)鏡下觀察在pRBC及HZ的浸潤(rùn)方面明顯不同，PQS組pRBC及HZ清晰可見(jiàn)，大量存在，而PQR組鏡下僅見(jiàn)個(gè)別pRBC；在組織的炎性反應(yīng)方面兩組均增強(qiáng)，無(wú)明顯差異，炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)均以淋巴、單核-巨噬細(xì)胞為主。由于PQS組一般只能存活6~9d，故9d后僅對(duì)PQR組各組織進(jìn)行了動(dòng)態(tài)觀察。PQR組9d起炎性反應(yīng)逐漸增加至17d時(shí)達(dá)峰值隨之在22d時(shí)下降。值得注意的是，兩組小鼠6d時(shí)肝、脾組織中炎性細(xì)胞增加未見(jiàn)明顯不同，且均以淋巴、單核-巨噬細(xì)胞為主，但其感染小鼠原蟲(chóng)浸潤(rùn)、病情發(fā)展截然不同。大量的研究已經(jīng)證明：不同類(lèi)型的淋巴、單核-巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞在疾病發(fā)展的不同時(shí)期發(fā)揮著不同的作用[11-12]，擬或抑制及清除原蟲(chóng)，遏制蟲(chóng)體血癥，降低炎癥反應(yīng)，發(fā)揮免疫保護(hù)作用，亦可發(fā)揮促炎功能，誘發(fā)免疫病理反應(yīng)，阻礙機(jī)體清除原蟲(chóng)，使疾病惡化。對(duì)于PQS及PQR兩組感染小鼠淋巴、單核-巨噬細(xì)胞具體的種類(lèi)分型有何不同、各自的作用還有待進(jìn)一步的研究確定。另外，在PQR組各組織中pRBC及HZ的浸潤(rùn)方面，雖然逐漸增加，在17d時(shí)達(dá)到峰值，但仍少于PQS組6d時(shí)，并在22d時(shí)下降減少，這種組織病理學(xué)的變化特點(diǎn)與小鼠感染后病情的轉(zhuǎn)歸及原蟲(chóng)毒力明顯減弱、致病力下降的抗性表征基本一致[2]。瘧原蟲(chóng)感染導(dǎo)致死亡的主要原因是腦型瘧并發(fā)多器官功能障礙綜合征[7]，腦型瘧的發(fā)病機(jī)制與機(jī)械阻塞及免疫病理相關(guān)，瘧原蟲(chóng)感染并在腦部粘附，誘導(dǎo)宿主抗感染的免疫細(xì)胞遷移至腦部并被激活，免疫細(xì)胞又促進(jìn)原蟲(chóng)在腦部粘附，最終使宿主腦部受到機(jī)械和免疫病理雙重?fù)p傷而發(fā)生腦型瘧[13]，聚集到腦部的pRBC數(shù)量及原蟲(chóng)的侵襲力是腦型瘧發(fā)生的關(guān)鍵因素。實(shí)驗(yàn)顯示：PQS組腦組織內(nèi)可見(jiàn)明顯的pRBC及HZ浸潤(rùn)，小血管內(nèi)pRBC及紅細(xì)胞聚集，并可見(jiàn)與血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附；PQR組則在6d時(shí)無(wú)明顯改變，直至22d腦組織中原蟲(chóng)始終很少。PQS與PQR兩組在感染相同宿主后的不同轉(zhuǎn)歸，即死亡與存活時(shí)間的不同，從腦組織病理特征的差異亦得到了證明。HZ是瘧原蟲(chóng)消化血紅蛋白后形成的一種高鐵血紅素聚合物，HZ的形成對(duì)于瘧原蟲(chóng)來(lái)說(shuō)是一種將有毒的游離血紅素進(jìn)行解毒的過(guò)程[14]，HZ與瘧原蟲(chóng)的毒力有關(guān)，其含量與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，腦型瘧及病情較重者.含量明顯高于病情較輕者[15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：各組織切片中PQR組的HZ明顯少于PQS組，以往的末梢血片鏡檢亦證實(shí)PQR株原蟲(chóng)中HZ的形成減少或消失[2-3]，這些為PbANKAPQR系毒力及致病力降低提供了佐證，但有關(guān)瘧原蟲(chóng)抗性與HZ的相關(guān)性及其機(jī)制還有待深入研究。PbANKAPQR系鼠瘧模型的組織病理改變與PQS系相比有明顯差別，該研究結(jié)果為瘧原蟲(chóng)的抗性機(jī)制的闡明提供了組織學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)，然而瘧原蟲(chóng)的抗性機(jī)制是十分復(fù)雜的課題，還需結(jié)合感染免疫調(diào)節(jié)機(jī)制等進(jìn)行深入研究。

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作者：黃憲希 周利民 沈笑 易國(guó)輝 薛偉玲 郭虹 單位：海南醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心