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【摘要】目的:建立BCR-ABL1+粒細胞白血病小鼠模型，為研究白血病的發病機制和藥物開發提供理想的平臺．方法:利用含有pMSCV-BCR/ABL1-IRES-GFP逆轉錄病毒上清感染6～10周齡C57BL/6供者小鼠的骨髓細胞，移植給致死量射線照射的同種同型受者小鼠，建立BCR-ABL1+粒細胞白血病小鼠模型;監測移植小鼠的體質量，生存率;流式細胞儀檢測小鼠外周血有核細胞GFP表達(代表有核細胞表達BCR/ABL1)和細胞分型;觀察小鼠脾臟、肺臟和肝臟等器官大體形態和HE染色變化．結果:移植20d后，移植小鼠呈現弓背、活動性減少、精神萎靡的狀態，體質量明顯降低;流式細胞儀檢測外周血中出現GFP+細胞，并且隨著移植時間的延長，GFP+粒細胞明顯增多．移植小鼠的生存率較對照組明顯降低．移植小鼠發病后呈現脾臟顯著增大、肺出血、肺臟及肝臟出現白色結節和HE染色呈現大量細胞浸潤，且小鼠脾臟中有核細胞的80%為GFP+Gr-1+細胞，即BCR-ABL1+粒細胞白血病細胞．結論:利用此方法成功建立了BCR-ABL1+粒細胞白血病小鼠模型，為研究慢性粒細胞白血病機制和治療提供了平臺．

【關鍵詞】BCR-ABL1+粒細胞白血病;BCR-ABL1;小鼠;生存率;逆轉錄病毒載體

0引言

慢性粒細胞白血病(chronicmyeloidleukemia，CML)是一種以粒細胞失去分化能力，過度增殖為特征的骨髓增生性疾病，是一種伴有t(9;22)(q34;q11)染色體易位的惡性增生性疾病［1］．該易位染色體由位于9號染色體的原癌基因ABL1部分序列從其正常位置易位至22號染色體的BCR區(breakpointclusterregion，BCR)形成［2］，其編碼的蛋白具有高度異常酪氨酸激酶活性，造成了CML細胞對酪氨酸激酶抑制劑的抵抗［3］．因此，研究CML的發病機制和治療藥物顯得尤為重要，而一個良好的實驗平臺是研究機制和藥理的基礎．研究［4－5］發現，雖然我們可以利用將CML患者的白血病細胞移植給NOD/SCID小鼠構建的小鼠模型來研究白血病細胞是否導致并維持了CML，但是這種模型不能造成致死性CML且耗時較長;而BCR-ABL轉基因小鼠模型由于不能完全發展成為髓系增生性疾病且具有潛伏期長的局限性，不利于治療藥物的研究［4－5］．逆轉錄病毒感染骨髓細胞的移植模型則是一種穩定高效的誘導方式［6］，可以為研究CML的發病機制和治療藥物提供幫助．本研究在逆轉錄病毒感染骨髓細胞移植模型的基礎上建立了更加省時、高效且易于監測病程和鑒定疾病類型的方式，成功建立了容易監測及鑒定的BCR-ABL1+粒細胞白血病小鼠模型，為CML的機制和藥物研究提供了一個良好的平臺．

1資料和方法

1．1材料

1．1．1載體和試劑

pMSCV-BCR/ABL1-IRES-GFP、pkat-ampac逆轉錄病毒包裝載體由本實驗室保存．5-Fluorouracil(5-Fu，Cat#6627)、HEPES和polybrene來自Sigma．抗小鼠Gr-1-APC(Cat#553129)流式抗體來自BD．SCF、IL-3、IL-6來自Peprotech．

1．1．2實驗動物

6～10周齡的C57BL/6小鼠購買并飼養于西安交通大學醫學部SPF級動物房．

1．2方法

1．2．1pMSCV-BCR/ABL1-IRES-GFP逆轉錄病毒的制備

用293T細胞培養基(DMEM培養液含有10%FBS、1%青鏈霉素，200mM谷氨酸和1%MEMnon-essential氨基酸)將293T細胞于10cm培養皿培養至密度為80%時，利用pMSCV-BCR/ABL1-IRES-GFP逆轉錄病毒載體轉染293T細胞，48h后收集pMSCV-BCR/ABL1-IRES-GFP逆轉錄病毒上清液立即使用或儲存－80．

1．2．2采集和體外培養供者小鼠骨髓細胞

要求供者和受者小鼠屬于同一品系．通常情況下，10只供者小鼠可提供2～3107骨髓細胞．第1天，取6～10周齡SPF級C57BL/6小鼠20只，尾靜脈注射0．6mL5-Fu/只，按200mg/kg計算．第4天時，處死小鼠獲取4～6107骨髓細胞，將供者骨髓細胞分為兩等分，即實驗組和對照組，用48mL骨髓細胞刺激培養基(含有77%DMEM，20%FBS，1%青鏈霉素，200mM谷氨酸，18ng/mL小鼠重組IL-3，20ng/mL小鼠重組IL-6以及100ng/mL小鼠重組SCF)分別懸于兩個六孔板中，在CO2培養箱內培養24h．

1．2．3pMSCV-BCR/ABL1-IRES-GFP逆轉錄病毒感染供者小鼠骨髓細胞

第5天，向實驗組的六孔板加入pMSCV-BCR/ABL1-IRES-GFP逆轉錄病毒第一次轉染骨髓細胞培養基(含有50%pMSCV-BCR/ABL1-IRES-GFP逆轉錄病毒上清，18ng/mL小鼠重組IL-3，20ng/mL小鼠重組IL-6，100ng/mL小鼠重組SCF，1%HEPES和20μg/mLpolybrene)，每孔2mL，對照組的六孔板加入骨髓細胞刺激培養基，每孔2mL，輕柔混勻后，室溫2300rpm離心90min，繼續在CO2培養箱中培養3～4h．室溫下1500rpm離心10min，丟棄上清液，各加入24mL骨髓細胞刺激培養基，過夜培養．第6天，向實驗組的六孔板加入pMSCV-BCR/ABL1-IRES-GFP逆轉錄病毒第二次轉染骨髓細胞培養基(含有50%pMSCV-BCR/ABL1-IRES-GFP逆轉錄病毒上清，18ng/mL小鼠重組IL-3，20ng/mL小鼠重組IL-6，100ng/mL小鼠重組SCF，1%HEPES和20μg/mLpolybrene)，每孔2mL，懸浮第一次轉染后的骨髓細胞，向對照組的六孔板加入骨髓細胞刺激培養基，每孔2mL，輕柔混勻后，室溫2300rpm離心90min，CO2培養箱培養3h．最后用Hank's緩沖液懸浮兩組骨髓細胞，準備注射受者小鼠．

1．2．4致死量射線照射受者小鼠并進行骨髓移植

第6天，采用醫用電子直線加速器(英國Eiekta)照射6～10周齡SPF級的C57BL/6小鼠12只，輻射劑量920cGy．將上述pMSCV-BCR/ABL1-IRES-GFP逆轉錄病毒感染后的供者小鼠骨髓細胞，尾靜脈注射給6只受照射后的受者小鼠作為實驗組，同樣，將未使用逆轉錄病毒感染后的供者小鼠骨髓細胞，尾靜脈注射給6只受照射后的受者小鼠作為對照組，細胞用量為1106/0．4mL/只．SPF級動物房飼養移植后小鼠．每隔一天觀察小鼠存活情況、稱取體質量;每周采用流式細胞儀檢測受者小鼠外周血GFP陽性細胞數量，即代表表達BCR-ABL1的細胞．大約15～20d可建立BCR-ABL1+粒細胞白血病小鼠模型．

1．2．5BCR-ABL1+粒細胞白血病小鼠模型的鑒定

1．2．5．1移植小鼠體質量和生存率監測

每隔一天稱取并記錄實驗組小鼠和對照組小鼠的體質量，計算實驗組小鼠和對照組小鼠的生存率．

1．2．5．2流式細胞儀檢測

每周取移植受者小鼠內眥血于抗凝劑中，經紅細胞裂解液裂解8min去掉紅細胞后，1PBS洗2次，檢測外周血有核細胞中GFP+白血病細胞的百分比并計數．將瀕死的移植受者小鼠處死后觀察小鼠脾臟，盡快收集病鼠的骨髓細胞及脾臟細胞，經紅細胞裂解液裂解5min去掉紅細胞后，1PBS洗2次，利用抗小鼠Gr-1抗體對移植受者小鼠的骨髓和脾臟細胞避光孵育20min，1PBS洗2次，1PBS懸起后流式細胞儀檢測進行免疫分型．以Gr-1+GFP+表示粒細胞白血病細胞．

1．2．5．3移植受者小鼠肺臟和肝臟HE染色

將瀕死的移植受者小鼠處死后觀察小鼠肺臟和肝臟，將肺臟和肝臟組織標本經石蠟包埋，切片和HE染色后，顯微鏡下觀察白血病細胞的浸潤情況．

2結果

2．1移植小鼠體質量和生存率變化

將pMSCV-BCR/ABL1-IRES-GFP逆轉錄病毒感染后的C57BL/6供者小鼠骨髓細胞，尾靜脈注射給受照射后的C57BL/6受者小鼠作為實驗組，以接受同樣劑量照射并移植未感染病毒的供者骨髓細胞的C57BL/6受者小鼠作為對照組，每隔一天稱取體質量，監測小鼠體質量變化．由于致死量照射，移植后的C57BL/6小鼠體質量呈現照射性降低，隨后在一周之內恢復體質量并且持續平穩，在移植后3周時，實驗組小鼠體質量連續降低，而對照組小鼠體質量保持平穩(圖1A)，C57BL/6實驗組小鼠與C57BL/6對照組小鼠的體質量變化比較，差異具有統計學意義(P＜0．05)．

2．2移植小鼠外周血白血病細胞監測情況

C57BL/6受者小鼠接受供者的小鼠骨髓細胞后，每周取移植受者小鼠內眥血，監測受者小鼠外周血中GFP+白血病細胞的水平．通過流式細胞儀檢測后發現，C57BL/6實驗組小鼠7d后外周血中即出現GFP+細胞(圖2A)，并且隨著移植時間推移，GFP+粒細胞明顯增多(圖2B)．至白血病細胞占外周血有核細胞80%時，小鼠迅速死亡．C57BL/6對照組小鼠外周血中始終未出現GFP+細胞．

2．3移植小鼠粒細胞白血病建模成功

骨髓移植20d左右時，實驗組小鼠呈現弓背、活動性減少、精神萎靡、進食減少的狀態(圖3A)．當實驗組小鼠體質量連續減輕且外周血白血病細胞持續增高時，處死實驗組小鼠和對照組小鼠，觀察肺臟、脾臟及肝臟，發現實驗組小鼠脾臟較對照組體積增大顯著，且出現肉眼可見大小不一數個白色突起(圖3B)，實驗組小鼠肺臟呈現出血、粗糙且布滿白色點狀結節(圖3C)，肝臟布滿白色結節(圖3D)．將肺臟和肝臟進行HE染色，觀察到實驗組小鼠肺臟和肝臟有大量白細胞浸潤(圖3E、3F)．將脾臟進行HE染色，同樣觀察到實驗組小鼠脾臟有大量白血病細胞浸潤(圖3G)，收集實驗組小鼠的骨髓細胞及脾臟細胞，通過流式細胞儀檢測發現脾臟中主要為大細胞(圖3H)，且脾臟中GFP+細胞占有核細胞的90%(圖3I)，利用抗小鼠Gr-1抗體對實驗組小鼠的骨髓和脾臟細胞進行免疫分型(以Gr-1+GFP+表示粒細胞白血病細胞)，通過流式細胞儀檢測發現脾臟中有核細胞的80%為GFP+Gr-1+細胞，進一步證實是BCR-ABL1+粒細胞白血病.

3討論

CML是一種由于粒細胞大量增生卻失去分化能力的髓系增生性疾病，來源于造血干細胞并且由于含有致癌基因BCR-ABL而獲得增殖快速于正常造血干細胞的優勢［7－8］，由于致癌基因產生的蛋白具有高度異常的酪氨酸激酶活性，持續活化其下游信號分子通路，促進了CML細胞的增殖和抗凋亡能力，造成CML細胞的惡性轉化［9］．在CML進程中CML-BP(blasticphase)患者對酪氨酸激酶抑制性藥物、異體造血干細胞移植、或者聯合化療效果均較差，死亡率極高［10］．此外，相對于CML-CP(chronicphase)期，CML-BP期基因組的復雜性和異質性均更高［11］．雖然酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼對CML的治療有革命性的突破，但是BCR-ABL1基因的突變產生了伊馬替尼的耐藥問題［12－13］．因此，研究BCR-ABL1+粒細胞白血病的發生、耐藥機制以及新的藥物對治療CML至關重要．雖然我們可以利用CML細胞異體移植小鼠模型和BCR-ABL轉基因小鼠模型來研究CML的發病機制，但是由于這些小鼠模型構建潛伏期較長，均不利于CML治療藥物的研究．本研究利用逆轉錄病毒感染骨髓細胞的移植模型具有穩定且潛伏期短的優勢，在其基礎上對照射方式進行了改進，使得照射一次性成功，耗時大大縮短，為實驗過程節省了寶貴的時間;此外，本研究還利用流式細胞儀檢測外周血有核細胞中GFP+白血病細胞數來監測整個病程周期，可以準確地了解移植受者小鼠的移植成功率和病程進展，為CML治療藥物的研究提供精確的控制窗口，使得便捷地觀測到藥物的治療效果成為可能．這種容易監測及鑒定的BCR-ABL1+粒細胞白血病小鼠模型，可以為CML的機制和藥物研究提供極大的幫助．BCR-ABL1逆轉錄病毒感染骨髓細胞移植模型可以誘導出3種疾病:類似于CML的髓系增生性疾病，急性淋巴細胞白血病以及單核細胞性白血病，表明BCR-ABL1逆轉錄病毒感染后的骨髓細胞呈現出一種混亂的造血方式［14－15］．

5-Fu為細胞周期特異性化療藥物，主要殺傷分裂期細胞，從而富集髓系多能干細胞，因此，本研究利用5-Fu處理供者小鼠的骨髓細胞，可以提高骨髓中髓系多能干細胞的百分比，使轉染效率極大提高，然后使用粒系干細胞所需的細胞因子培養供者骨髓細胞，能夠導致髓系干細胞向粒系發展，最終發展為CML小鼠模型［16］．本研究利用細胞因子體外培養5-Fu處理后小鼠供者骨髓細胞，再利用BCR-ABL1-GFP逆轉錄病毒感染供者的骨髓細胞，并移植給致死量照射后的同種系受者小鼠，通過監測受者小鼠的體質量、生存率、流式細胞儀檢測受者小鼠外周血有核細胞表達GFP的情況來判定小鼠的病程進展，簡單且高效，此外，利用抗小鼠Gr-1抗體對發病后的受者小鼠的骨髓和脾臟細胞進行免疫分型，進一步證實了BCR-ABL1+粒細胞白血病的小鼠模型建立成功，利用流式檢測技術可以高效地監測整個建模過程，且容易判定模型類別．此外，通過觀察受者小鼠脾臟和肺臟等器官，我們發現白血病細胞于肺臟和肝臟均有浸潤，這顯示我們的模型起源于骨髓造血干細胞且具有多器官浸潤的能力，這與人的CML較為相似，可以作為較理想的CML小鼠模型，為CML治療藥物的研究提供易觀測、易控制的平臺，為白血病的治療提供較大的幫助．

作者：張萍；李琛；鄭銘喆；張華；季延紅 單位：西安交通大學醫學部基礎醫學院病原生物學和免疫學系