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［摘要］目的:探究白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor，LIF)對人牙周膜細胞(humanperiodontalligamentcells，HPDLCs)成骨分化能力的影響。方法:分離培養HPDLCs，分別為空白對照組、標準骨誘導組和加入重組人白血病抑制因子(recombinanthumanleukemiainhibitoryfactor，rhLIF)的骨誘導組。7d后堿性磷酸酶(alkalinephos-phatase，ALP)染色及活性檢測，21d后礦化結節染色和定量分析，實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測第5dHPDLCs中成骨相關基因ALP、骨涎蛋白(bonesialoprotein，BSP)和骨鈣蛋白(osteocalcin，OCN)的mRNA表達量。結果:7d后，標準骨誘導組ALP染色呈深藍色，LIF刺激后，染色明顯變淺，活性顯著下降(P＜0.01)。21d后，標準組HPDLC有大量礦化結節形成，而LIF組明顯減少(P＜0.05)，qRT-PCR結果顯示標準組ALP、BSP和OCN的表達顯著提高(P＜0.01)，而LIF刺激后，表達明顯降低(P＜0.01)。結論:LIF可抑制HPDLC的成骨向分化。

［關鍵詞］白血病抑制因子;牙周膜細胞;成骨

牙周膜細胞(periodontalligamentcells，PDLC)是一組具有異型性的細胞群，包含具有分化潛能的牙周干細胞，可分化為成骨細胞、成牙骨質細胞、成纖維細胞等［1］。PDLC的成骨向分化后，具有成骨細胞的表型和特性［2］。因而，PDLC在牙槽骨的改建中扮演重要角色，PDLC成骨向分化是牙槽骨改建的前提之一。白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor，LIF)屬于IL-6細胞因子家族中的一員，是一種多功能的細胞因子，其廣泛存在于成纖維細胞、上皮細胞、胚胎干細胞、骨髓基質細胞、成骨細胞和破骨細胞之中。近年來的研究發現，LIF能調節骨代謝，既參與了骨形成過程［3，4］，又參與了骨吸收過程［5，6］，在調節骨組織改建中發揮重要作用。因此，LIF是否在PDLC成骨向分化中發揮作用，從而參與牙周組織改建。本實驗將利用體外培養人牙周膜細胞(humanperiodontalligamentcells，HPDLCs)模型，觀察LIF對HPDLC成骨向分化的影響，初步探討其在牙周組織改建和再生中可能的作用。

材料和方法

1HPDLC的分離培養與鑒定選取

10～14歲兒童因正畸需要而拔除的健康前磨牙，取牙周組織塊進行貼壁培養。從第4d開始，每3d換液1次。同時，倒置熒光顯微鏡下觀察，當組織塊邊緣游出的細胞增多且密集到一定程度時，進行傳代，選用第3～5代培養的細胞用于實驗。本實驗經深圳市鹽田區人民醫院醫學倫理委員會批準。形態學鑒定:倒置顯微鏡下觀察細胞由組織塊邊緣游出的情況，觀察細胞形態及傳代后細胞生長狀況。免疫學鑒定:取生長狀態良好的第4代HPDLCs接種于置有蓋玻片的6孔培養板中，待細胞長至80%時取出玻片，4%多聚甲醛固定，用免疫組化SP法進行波形絲蛋白和細胞角蛋白染色。

2LIF對HPDLC成骨向分化的影響

2.1礦化誘導

取第3代HPDLCs，用胰蛋白酶消化后，以5×104個/mL的濃度接種于24孔板中，每孔液量為1mL。分別為空白對照組、標準骨誘導組和加入重組人白血病抑制因子(recombinanthumanleukemiainhibitoryfactor，rhLIF)的骨誘導組，每3d換液1次。

2.2堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)染色

礦化誘導液培養7d后PBS液沖洗，用70%乙醇固定1h，PBS沖洗3遍。然后用ALP染色試劑盒避光染色30min后，用雙蒸水沖洗，終止反應。

2.3ALP活性檢測

三組細胞均培養7d后用PBS清洗，然后用1%TritonX-100裂解細胞。采用PNPP法進行測定，用PNP做標準曲線，計算ALP活性，溶胞產物中蛋白含量用BCA蛋白測試盒測定。

2.4礦化結節染色及定量分析

培養21d后，PBS沖洗，用70%乙醇固定1h。然后進行茜素紅染色及定量分析。

2.5實時熒光定量

PCR(qRT-PCR)檢測培養5d后，用Trizol提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，引物序列如表1。用SYBRGreenKit檢測ALP、BSP和OCN的表達。

結果

1免疫學鑒定

所培養的細胞經SP免疫細胞化學檢測呈抗波形絲蛋白陽性，抗角蛋白陰性，符合成纖維樣細胞的特征。證明細胞來源于中胚層，且無上皮源性細胞混雜，陰性對照組均未見陽性染色結果(圖1)。

2LIF對HPDLC成骨向分化的影響

2.1LIF抑制HPDLC的ALP活性礦化誘導

7d后，ALP染色呈深藍色，而加入外源性LIF刺激后，染色明顯變淺(圖2A)。從ALP活性檢測中可看出，礦化誘導7d后，HPDLC的ALP活性比對照組明顯增強，但加入外源性LIF刺激后，ALP活性顯著下降(圖2B)。

2.2LIF抑制HPDLC的礦化結節形成

茜素紅染色后可見，礦化誘導后HPDLC有大量礦化結節形成，而加入LIF處理的HPDLC中少有礦化結節形成。其qRT-PCR定量分析顯示，LIF處理過的HPDLC礦化誘導后的吸光光度值顯著低于未經LIF處理的陽性對照組(P＜0.05)，說明LIF顯著抑制了HPDLC的礦化(圖3)。

2.3LIF抑制HPDLC的成骨相關基因的表達

礦化誘導后ALP、BSP和OCN的表達比對照組有顯著提高(P＜0.01)，但外源性LIF刺激后，ALP、BSP和OCN的表達卻明顯降低(P＜0.01)(圖4)。

討論

本研究中，LIF作用后，HPDLC的成骨向分化水平顯著降低，提示LIF抑制了HPDLC的成骨向分化。且LIF降低HPDLC活性的結果和LIF可降低MC3T3-E1細胞中ALP活性和Ⅰ型膠原mRNA的表達［6］相一致。而LIF抑制HPDLC礦化結節的形成及ALP、BSP和OCN基因的表達的結果，與Malaval等［4］的研究結果相一致:在從出生21d的大鼠顱蓋骨中分離培養的細胞的骨向分化過程中，LIF劑量依賴性的抑制礦化結節的形成;同時，LIF降低了ALPmRNA的表達和活性，且明顯抑制BSP和OCN的表達。然而，也有實驗表明，LIF可以直接刺激成骨細胞的增殖、分化，以及誘導ALP的表達［7］。與本實驗結果相差異，是由于所選用的細胞來自不同的細胞體系，來自不同的個體。也有可能與細胞性質不同，或實驗用細胞的差異相關，如細胞來自生長期的不同階段、取材的部位不一致、或固有的分化能力就有所不同。LIF本身這種促骨形成的矛盾提示，LIF對骨祖細胞的分化增殖以及骨形成的作用非常復雜。與特定的細胞分化階段有關。跟骨祖細胞所處的分化階段不同、細胞培養所處的環境不一樣及細胞系來源的不同，受體轉化機制有關。Malaval等［4］研究發現，白血病抑制因子受體(leukemiainhibitoryfactorreceptor，LIFR)和致癌蛋白M受體(oncostatinMreceptor，OSMR)在骨祖細胞的表型和分化中起著不同的作用，極有可能是通過不同的信號轉導通路。Falco-ni等［8］研究證實成骨細胞的分化與透明質酸(haluron-icacid，HA)的表達水平密切相關，LIF通過刺激透明質酸合成酶2(hyaluronansynthase2，HAS2)，來合成高分子量的HA，進而抑制成骨細胞的生長。而PDLC作為牙周組織中的優勢細胞，可通過增殖和分化［9］，參與牙周膜和牙槽骨的改建。LIF作為IL-6家族的主要成員，可由機體許多組織誘導產生并具有廣泛的生物學活動。IL-6、LIF、OSM這些IL-6家族中的細胞因子，可刺激破骨細胞的形成并調節其功能，有學者［10］發現IL-6家族的細胞因子能通過gp130和上調STAT轉錄因子的活性來刺激基質細胞與成骨細胞中RANKL的表達。在以往證明PDLC可表達成骨細胞特征的基礎上，Kanzaki等［11］從基因和蛋白水平證明了PDLC表達OPG和RANKL，并受到1α，25(OH)2維生素D3的調節［12］。OPG和RANKL是由成骨細胞產生的直接控制破骨細胞生成的功能因子。目前認為成骨細胞通過OPG和RANKL影響破骨細胞的生成［13，14］。因此，當發生牙周炎或受外界環境刺激時，PDLC分泌產生的LIF可能促進成骨樣PDLC分泌大量的RANKL，而RANKL識別破骨前體細胞上的RANK，使破骨細胞分化成熟而引起骨吸收進而抑制HPDLC成骨向分化。本課題組前期實驗表明，LIF通過JAK2/STAT3信號通路抑制牙髓細胞向成牙本質樣細胞的分化［15］，其可能的機理是IL-6家族(和LIF同家族)可激活人乳腺癌細胞中STAT3的活性和Twist的表達［16］，而Twist是一個強的成骨細胞分化的抑制子，Twist-1基因敲除小鼠身上ALP活性增加、I型膠原和DSPP表達顯著增高、早期牙本質基質的形成和髓腔中髓石的形成明顯增多［17］。因此，LIF也有可能通過這條機理抑制PDLC的礦化。另一方面也有可能與LIF的保持細胞多功能分化潛能和允許其自我更新的特性有關。LIF在人骨髓基質干細胞中也對干細胞的分化有負調節作用，在未分化的骨髓基質細胞中LIF有更高水平的表達。且在本課題組的相關實驗中發現，在HPDLC傳代培養過程中，外源性LIF刺激下的HPDLC中Stro-1和CD146這兩個干細胞標記的陽性表達率比正常HPDLC高。說明LIF對HPDLC的多分化具有負調節作用。而HPDLC和骨髓基質細胞、牙髓細胞及胚胎干細胞一樣具有自我更新和維持多分化潛能的能力。因此，LIF對HPDLC骨向分化的抑制作用可能跟LIF保持HPDLC多功能分化潛能和允許其自我更新的特性有關。

作者：梁又德 傅潤英 劉根 游新 宋大為 單位：深圳市第七人民醫院口腔中心