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作者：黃枝梅劉智禹蘇捷吳靖娜陳紹軍單位：福建省水產研究所福建農林大學食品科學學院

河豚毒素（Tetrodotoxin，簡稱TTX）是一種劇毒的天然非蛋白質類神經毒素，分子式為C1lH17N3O8，是典型的Na+通道阻滯劑，經腹腔注射對ICR品系小鼠的LD50為0.178μg/kg。但TTX具有特殊的生理活性和藥理作用，研究表明，TTX具有鎮痛消炎、降血壓、抗心律失常、局麻、緩解肌肉痙攣、戒毒及抑制腫瘤等功效，其高活性和高特異性的生物特性具有潛在的醫藥開發價值，在臨床方面也有廣闊的應用前景。由于河豚毒素的中毒劑量和治療劑量很接近，很容易使人中毒，因此，為避免河豚毒素在臨床應用中產生全身毒性反應，目前已研制出河豚毒素微膠囊。目前，國內外對TTX的提取有很多報道，主要有水浴法、浸提法等。林文鑾等提出以甲醇乙酸法提取TTX較完全，用活性炭脫色純化的效果最好，但毒力有一定的損失。楊春等[5]以棕斑腹刺鲀（Lagocephaluswheeleri）為對象，研究以甲醇、乙醇、乙酸、水等4種溶劑提取TTX，結果表明，以乙酸提取效果最好。李世平等以減壓濃縮法去除提取液中的乙醚，改進了乙酸提取法，提高了TTX提取得率。蘇捷等采用去除油脂、蛋白、活性炭吸附、陽離子交換、分子篩層析等方法得到高純度的河豚毒素。超聲波提取法是利用超聲波具有的機械效應、空化效應及熱效應，通過增大介質分子的運動速度和增大介質的穿透力以提取生物有效成分的方法，與傳統浸提法相比，超聲波提取具有提取率高，提取時間短，不改變所提取成分的化學結構和生理活性，節約原材料和溶劑等優點。有關超聲波提取TTX的研究較少，僅見闞麗麗等以河豚內臟為原料，研究超聲波提取TTX時的超聲時間、乙酸用量、提取次數等工藝條件的提取效果的報道，該研究表明，以超聲法輔助提取河豚毒素的含量優于水浴法及回流提取法。本研究以月腹刺鲀（Gastrophysuslunaris）卵巢為原料，研究超聲波輔助提取TTX的工藝條件，用二次旋轉回歸實驗建立液料比、超聲溫度、超聲時間與提取量的關系模型，并用響應面法對提取工藝條件進行優化，旨在為TTX的工業化提取提供依據。

1材料與方法

1.1材料

月腹刺鲀（Gastrophysuslunaris），廣東深圳沿海；雄性昆明小鼠，20g左右，廈門大學醫學院。藥品試劑：乙酸、甲醇、無水乙醇等，分析純（AR），汕頭市西隴化工廠有限公司；TTX標準對照品，純度≥98%，河北省水產科技開發公司。儀器設備：KQ-100DB型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；DK-S16型電熱恒溫水浴鍋，上海森信實驗儀器有限公司；TDL-40B臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；R系列旋轉蒸發器，上海坤生科技有限公司。

1.2方法

1.2.1樣品處理稱取10.0g月腹刺鲀卵巢，用組織勻漿器打碎，加入適量有機溶劑，采用超聲波輔助提取，冷卻后以4000r/min離心5min，上清液通過快速定性濾紙過濾，濾液以乙醚脫脂，定容，4℃下保存備用。

1.2.2超聲波提取的單因素實驗

1.2.2.1提取溶劑的選擇固定液料體積質量比（mL/g，下同，下稱“液料比”）3∶1，超聲溫度40℃，超聲功率60W，超聲時間30min，提取1次，分別以乙酸、乙酸甲醇和乙酸乙醇水溶液為提取溶劑，研究不同溶劑對TTX提取效果的影響。

1.2.2.2液料比對TTX提取效果的影響以體積分數0.1%的乙酸水溶液為提取溶劑，固定超聲溫度40℃，超聲功率60W，超聲時間30min，提取1次，改變液料比為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1和5∶1，研究液料比對TTX提取效果的影響。

1.2.2.3超聲溫度對TTX提取效果的影響以體積分數0.1%的乙酸水溶液為提取溶劑，固定液料比3∶1，超聲功率60W，超聲時間30min，提取1次，改變超聲溫度為20、30、40、50和60℃，研究超聲溫度對TTX提取效果的影響。

1.2.2.4超聲功率對TTX提取效果的影響以體積分數0.1%的乙酸水溶液為提取溶劑，固定液料比3∶1，超聲溫度30℃，超聲時間20min，提取1次，改變超聲功率為40、60、80和100W，研究超聲功率對TTX提取效果的影響。

1.2.2.5超聲時間對TTX提取效果的影響以體積分數0.1%乙酸的水溶液為提取溶劑，固定液料比3∶1，超聲溫度30℃，超聲功率60W，提取1次，改變超聲時間為10、20、30、40和50min，研究超聲時間對提取效果的影響。

1.2.2.6提取次數對TTX提取效果的影響以體積分數0.1%的乙酸溶液為提取溶劑，固定液料比3∶1，超聲溫度30℃，超聲功率40W，超聲時間20min，分別提取1次、2次、3次和4次，研究提取次數對TTX提取效果的影響。

1.2.3TTX含量的測定TTX測定采用昆明小鼠生物檢測法[7]，在檢測過程中，每個TTX樣品分別腹腔注射3只小鼠以檢測TTX含量，即分別進行3次檢測。除1.2.2.3中的溫度實驗外，其余數據均取3次檢測的平均值。標準曲線的繪制及檢測步聚參照吳韶菊[11]。以小鼠平均死亡時間的倒數為橫坐標，小鼠單位體重TTX注射劑量（以20.0g為小鼠單位體重）為縱坐標，作標準曲線（圖1），其線性回歸方程為y=3360.6x+154.35，r=0.9971。

1.2.4TTX得率的計算計算公式：

1.2.5實驗設計通過單因素實驗，確定影響TTX提取的關鍵因素，并采用三元二次回歸旋轉組合設計對3個主要因素進行回歸實驗，繪制響應面圖，研究影響較大的因素的主效應和交互效應，以求得最佳工藝。

2結果與討論

2.1超聲波提取TTX的單因素實驗

2.1.1提取溶劑的選擇圖2表明，3種溶劑提取TTX的效果不同：乙酸甲醇的提取效果最好，得率為58.68μg/g，乙酸水次之，乙酸乙醇的提取效果最差。但是，由于乙酸水的得率僅比乙酸甲醇低1.95μg/g，考慮到甲醇毒性較強，可能對小鼠檢測結果產生影響，因而選擇體積分數0.1%的乙酸水溶液作為提取溶劑。

2.1.2液料比對TTX提取效果的影響圖3可見，隨著液料比的遞增，TTX得率呈不斷增加趨勢。當液料比為3∶1時，TTX得率為57.46μg/g；當液料比超過3∶1時，TTX得率增加趨于平緩，說明此時溶劑已基本將目標物質提取出來。一般來講，液料比越大，目標物質提取越徹底，提取效果也越好。但溶劑用量大必然造成后來濃縮工藝的延長，使得整體工作效率下降，成本上升[12]。因此，選擇液料比3∶1。

2.1.3超聲溫度對TTX提取效果的影響表1表明，30℃的超聲溫度提取效果最好，TTX得率為58.89μg/g。20℃與30℃下提取效果差異極顯著（P<0.01），30℃與40℃下提取的TTX得率也存在極顯著差異（P<0.01）。但50℃時的TTX提取量明顯下降，與60℃不存在顯著差異（P>0.05）。因此，采用超聲溫度為30℃。

2.1.4超聲時間對TTX提取效果的影響圖4可見，10～20min超聲期間，TTX得率明顯升高，20min時得率達到最大值59.58μg/g；再延長提取時間得率反而降低。因此，選用20min進行超聲提取比較合適。

2.1.5超聲功率對TTX提取效果的影響圖5表明，TTX的得率隨著超聲功率的增大有所下降，當功率為40W時，TTX得率最高，為60.24μg/g。因此，選擇超聲功率為40W。

2.1.6提取次數對TTX提取效果的影響圖6表明，隨著提取次數從1次增加到4次，TTX得率從60.12μg/g增加至60.85μg/g，增加的幅度不大。考慮到提取次數越多，原料中其他成分溶出也越多，增加了分離純化的難度。從經濟效益和時間的角度考慮，提取次數選擇1次。

2.2超聲波提取河豚毒素的二次回歸實驗

在單因素實驗的基礎上，得到影響TTX提取量的3個主要因素為液料比、超聲溫度和超聲時間，與闞麗麗的實驗設計略有不同[10]。根據單因素實驗確定各因素的上下水平，并按照三元二次回歸旋轉組合設計原理設計實驗。實驗設計方案及結果如表2所示。利用相關程序對所得數據進行模擬，得液料比（X1）、超聲溫度（X2）和超聲時間（X3）影響TTX得率（Y）的回歸方程如下：表3回歸模型方差分析結果表明，各因素對TTX得率的影響程度依次為超聲溫度、液料比、超聲時間。其中，超聲溫度和液料比的影響極顯著（P<0.001），直接關系到TTX的提取得率。在α=0.01顯著水平上剔除不顯著因素項，得到簡化后的回歸方程：

2.3超聲波提取工藝的響應面法優化

2.3.1單因子效應分析對上述數學模型進行降維分析，將三因素中的兩個因素固定在零水平，觀察其中一個單因素在各水平上對TTX得率的影響效應，得到以其中一個因素為決策變量的偏子回歸模型，結果如圖7所示。液料比曲線先隨著編碼的增加而增大，在零水平時達到最大值，超過此水平曲線呈緩慢下降趨勢；溫度曲線隨著溫度的升高得率增加很快，在編碼值為1.5左右出現峰值，然后趨于緩和；超聲時間曲線在實驗所給定的范圍內變化較小，零水平左右有最大值。因此，在采用超聲波提取TTX的過程中，要特別關注溫度的取值。

2.3.2因素間交互作用響應面分析響應面圖形是特定的響應值對應的因素構成的一個三維空間在二維平面上的等高線，可以直觀地反映各因素的交互作用以及對響應值的影響[8]。分別將液料比、超聲溫度和超聲時間3個因素中的一個固定為零水平，根據上述回歸方程Y1作出響應面分析圖和等高線圖見圖8~10。圖8~10表明，各實驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系，而是二次關系。當液料比在零水平左右，超聲溫度在+1.5水平左右，超聲提取時間在+0.5水平左右，擬合曲面有最大值。為進一步確定超聲提取參數的最佳值，對擬合方程求一階偏導，解方程得X1=0.05、X2=1.5、X3=0.42時，Y1=62.61。即當液料比為3.03∶1，控制超聲溫度39℃，提取22.5min，TTX得率最高為62.61μg/g。對液料比3∶1、超聲溫度40℃、提取22min進行驗證實驗，TTX的平均得率為63.57μg/g，優于回歸實驗中的任一組，與預測量的相對標準偏差（RSD）為1.08%，表明該工藝是穩定可行的。

3結論

1）提取溶劑選擇的實驗結果表明，乙酸甲醇水溶液的提取效果最好，乙酸水溶液提取量比乙酸甲醇溶液低1.95μg/g。考慮到甲醇的毒性較強及成本較高等原因，實驗選擇體積分數0.1%的乙酸水溶液作為提取溶劑。

2）TTX提取量隨著提取次數的增加而增大，但增加幅度不大。提取次數越多，原料中其他成分溶出也越多，增加了分離純化的難度，故提取次數選擇1次。

3)液料比、超聲溫度和超聲時間是TTX超聲提取的主要影響因素，與TTX得率之間的回歸模型為：Tukey法方差分析表明，影響TTX得率的各因素大小依次為：液料比、超聲溫度、超聲時間。方程R2為0.9824，表明回歸方程極顯著，對TTX實際提取結果有良好預測作用。

4）超聲波輔助提取河豚毒素的最佳工藝條件為液料比3∶1，超聲溫度40℃，超聲時間22min，該工藝條件下的提取率達63.57μg/g。