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作者：殷宏金涌邢仕歌田世民單位：中國檢科院綜合檢測中心毒理實(shí)驗(yàn)室北京

自從1957年Waddington提出表觀遺傳學(xué)的概念后，表觀遺傳學(xué)和表觀基因組學(xué)有了相當(dāng)大的發(fā)展。表觀基因組學(xué)是在全基因組水平上研究表觀遺傳學(xué)標(biāo)志及其與基因表達(dá)的相互關(guān)系。這一新興領(lǐng)域已對毒理學(xué)研究與實(shí)踐產(chǎn)生重大的影響。國內(nèi)，表觀遺傳學(xué)在毒理學(xué)研究已較深入地開展了一些研究，并發(fā)表了綜述。

1外源化學(xué)物的表觀遺傳毒性

基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控是通過DNA甲基化，組蛋白編碼和相關(guān)的非編碼RNA(如miRNA)來完成的。3種機(jī)制各自的貢獻(xiàn)取決于特定基因及其環(huán)境，如物種，細(xì)胞類型，機(jī)體的發(fā)育階段和年齡，此外，每個因素可能受到其他因素的影響。因此，表觀基因組的調(diào)控是一個強(qiáng)大的和動態(tài)的綜合過程，在發(fā)育和維持分化狀態(tài)中起關(guān)鍵作用。雖然表觀基因組不是所有的改變預(yù)期都是有害的，但有些可能產(chǎn)生有害結(jié)果(如發(fā)育異常，增加疾病易感性等)。在體外，動物和人類的研究已經(jīng)確定了幾類環(huán)境化學(xué)物，可以修飾表觀遺傳標(biāo)志，包括金屬、過氧化物酶體增殖劑、空氣污染物、毒物和內(nèi)分泌干擾物/生殖毒物。目前環(huán)境化學(xué)物表觀遺傳標(biāo)志的研究大多數(shù)集中在DNA甲基化，只有少數(shù)研究涉及組蛋白修飾和miRNA(表1～3)。外源化學(xué)物引起表觀遺傳學(xué)改變可影響細(xì)胞應(yīng)激，并是潛在可逆的;也可能是可遺傳的。表觀遺傳毒性(epigenotoxicity)是指脫離外源化學(xué)物暴露后，可遺傳的有害改變。廣義的表觀遺傳毒性也可以包括外源化學(xué)物引起非遺傳的表觀遺傳學(xué)改變中介的外源化學(xué)物毒效應(yīng)?？蛇z傳的表觀遺傳毒性和表觀遺傳改變中介的毒效應(yīng)是有區(qū)別的。表觀遺傳毒性可以被分為有絲分裂的，減數(shù)分裂的或跨代遺傳的3類。表觀遺傳毒性這一新興研究領(lǐng)域?qū)Χ纠韺W(xué)產(chǎn)生了重大的影響。下文主要討論目前表觀遺傳毒性測試的主要發(fā)現(xiàn)及國際生命科學(xué)研究所(ILSI)“評估表觀遺傳變化”的研討會的意見。

2表觀遺傳毒性的主要發(fā)現(xiàn)

2.1化學(xué)致癌近年來在多種腫瘤細(xì)胞觀察到表觀遺傳事件。表觀遺傳事件可能引起基因表達(dá)的變化通過DNA甲基化，組蛋白修飾和/或染色質(zhì)重構(gòu)。并估計(jì)，在腫瘤細(xì)胞中檢測到甲基化變化的數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于遺傳改變的數(shù)目。研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳事件參與環(huán)境與職業(yè)因子誘發(fā)癌變進(jìn)程的引發(fā)和進(jìn)展。DNA甲基化異常對腫瘤發(fā)生有因果關(guān)系作用，甲基胞嘧啶增加突變可能性，增加致癌物結(jié)合，腫瘤抑制基因沉默，DNA修復(fù)基因沉默，癌的DNA低甲基化和遺傳學(xué)改變。組蛋白修飾可能通過影響DNA修復(fù)和細(xì)胞周期關(guān)卡，引起遺傳學(xué)改變。傳統(tǒng)的致癌性試驗(yàn)可確定表觀遺傳修飾誘導(dǎo)腫瘤的可能性。許多不同的嚙齒類致肝癌物已被確定，而研究發(fā)現(xiàn)這些化合物的作用模式并無遺傳毒性，與人類也無關(guān)聯(lián)性。例如過氧化物酶體增殖物激活受體-α(PPAR-A)介導(dǎo)的和構(gòu)成性雄甾烷受體(CAR)介導(dǎo)的嚙齒類動物癌變。肝腫瘤促長劑苯巴比妥(PB)，其與CAR的激活和隨后的效果相關(guān)。PB誘導(dǎo)的嚙齒類表觀遺傳學(xué)改變包括甲基化改變的區(qū)域，基因表達(dá)的特殊改變和外源性及內(nèi)源性化合物的代謝。持續(xù)的核受體介導(dǎo)的肝臟致癌物的分子分析，將更加明確地表征每個受試化合物的作用模式。表觀基因組正常變異性的表征和與處理相關(guān)的表觀遺傳學(xué)影響的理解，將是研究致癌作用模式的巨大挑戰(zhàn)。

2.2遺傳毒理學(xué)評價化學(xué)物引起遺傳損傷的能力是風(fēng)險評定的重要內(nèi)容。表觀遺傳學(xué)影響基因表達(dá)的可遺傳的變化可能構(gòu)成遺傳毒性。表觀遺傳導(dǎo)致基因改變的機(jī)制包括:錯配修復(fù)基因表觀遺傳缺陷，增加DNA修復(fù)基因表觀遺傳缺陷與癌癥特定突變譜相關(guān)，參與雙鏈斷裂修復(fù)的基因的表觀遺傳失活，有絲分裂關(guān)卡基因表觀遺傳缺陷，致癌物解毒基因與甲基胞嘧啶突變可能性增加，DNA全面低甲基化和染色體不穩(wěn)定等。已經(jīng)確定表觀遺傳學(xué)改變在腫瘤形成中具有一定的作用。在腫瘤發(fā)展過程中DNA甲基化模式的改變往往是最早觀察到的分子事件。甲基胞嘧啶(5meC)已知是C∶G至T∶A轉(zhuǎn)換突變的熱點(diǎn)，起因于胞嘧啶自發(fā)性水解和酶脫氨基率的增加和DNA修復(fù)降低。增加的5meC脫氨基率和T堿基修復(fù)受限可解釋在CpG位點(diǎn)突變頻率的增加。人類腫瘤p53基因突變的1/4和腫瘤抑制基因p16的C-T轉(zhuǎn)換的1/3已知會發(fā)生在CpG位點(diǎn)上。突變的增加也可能來自于飲食中甲基供體的不足。已證明葉酸補(bǔ)充劑能減少潰瘍性結(jié)腸炎患者發(fā)生結(jié)腸癌的風(fēng)險和和預(yù)防結(jié)腸癌細(xì)胞p53突變。參與葉酸代謝的酶遺傳多態(tài)性影響表觀遺傳標(biāo)志，改變SAM水平，并能調(diào)節(jié)結(jié)腸癌的風(fēng)險。也已提出DNA氧化性損傷在癌癥的發(fā)生、心血管疾病和衰老中所起的作用。8-羥基鳥嘌呤(8oxoG)改變了CpG二核苷酸相鄰的C的甲基轉(zhuǎn)移酶活性，可能改變DNA甲基化。在CpG內(nèi)C5-位的損傷影響DNA甲基化。在體外，5meC和5-氯C因啟動子甲基化引起次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Hgprt)基因的沉默。此外，CpG內(nèi)的8oxoG和HmC或顯著減少結(jié)合于DNA的MeCP2，并直接導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變。光二聚物，烷基化堿基，脫堿基位點(diǎn)，以及鏈斷裂也會誘導(dǎo)DNA的甲基化變化。對性細(xì)胞的致突變性將于下文討論。體外哺乳動物細(xì)胞基因突變試驗(yàn)?zāi)軌蚝Y選表觀遺傳學(xué)介導(dǎo)的危害。例如，在不同嚙齒類細(xì)胞系經(jīng)5-氮胞苷處理TK基因可恢復(fù)活性。此外，DNA合成抑制劑3-疊氮基-3-脫氧胸苷(AZT)可引起TK位點(diǎn)超甲基化。應(yīng)進(jìn)一步開發(fā)篩選試驗(yàn)以確定表觀遺傳學(xué)中介的遺傳毒性。

2.3發(fā)育與生殖的表觀遺傳毒理學(xué)完全分化的體細(xì)胞，在正常情況下，將有相對穩(wěn)定的表觀基因組傳遞到子代細(xì)胞。但在哺乳動物的發(fā)育過程中，早期胚胎發(fā)育過程(著床前)，以及在子宮內(nèi)原始生殖細(xì)胞的發(fā)育過程中，有兩個表觀遺傳學(xué)的重編程階段，重新設(shè)置DNA的甲基化模式。這兩個發(fā)育的表觀遺傳重編程事件有可能是破壞表觀遺傳編程的敏感窗口。發(fā)育和生殖毒理學(xué)家特別感興趣的是毒物暴露是否可以直接改變發(fā)育的表觀基因組，有害的表型是否可跨代遺傳，及因此存在的潛在危害。表觀遺傳編程紊亂可能有助于對表型的跨代遺傳。使用Avy小鼠(黃色刺小鼠)模型，飲食暴露雙酚A，使Avy和CabpIAP亞穩(wěn)外延等位基因低甲基化。甲基供體膳食補(bǔ)充劑或染料木素可抵消此低甲基化效應(yīng)。這些結(jié)果與造成表觀遺傳影響的其他內(nèi)分泌干擾物報告一致。在環(huán)境相關(guān)水平低濃度的雙酚A(1.2和2.4μg/kg體重)對大鼠可誘導(dǎo)跨代遺傳表型異常。暴露于雙酚A圍生期雄性后代的精子計(jì)數(shù)和精子活力降低，并在F3代持續(xù)這些表型。甲氧滴滴涕和乙烯菌核利在子宮中暴露也會導(dǎo)致跨代生殖遺傳表型異常。雖然甲氧氯和乙烯菌核利在高于人類接觸的劑量觀察到病理學(xué)改變，但此研究提供了一個模型來研究表觀遺傳跨代的機(jī)制。已證明，乙烯菌核利暴露后破壞了多達(dá)3代的小鼠精子一些印跡基因甲基化模式，這表明跨代遺傳異常的表型也有表觀遺傳的基礎(chǔ)。

2.4免疫毒理學(xué)已發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳調(diào)控多能幼稚輔助性T細(xì)胞(Th)分化的啟動和其效應(yīng)亞群的成熟。啟動后不久，幼稚T細(xì)胞同時轉(zhuǎn)錄低水平的Th1(CD4)和Th2(CD8)細(xì)胞因子，包括IL-2。在選擇性轉(zhuǎn)錄成為Ifng(Th1細(xì)胞因子標(biāo)記)或Th2細(xì)胞因子基因(IL-4和IL-5，IL-13)之前需要幾次復(fù)制。在體外用5-aza誘導(dǎo)T細(xì)胞，導(dǎo)致由早先不產(chǎn)生這些細(xì)胞因子的T細(xì)胞系產(chǎn)生IL-2和IFN-g。在用組蛋白去乙酰酶抑制劑處理的CD4T細(xì)胞研究證實(shí)干擾素IFN-G和Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)增強(qiáng)。上述研究結(jié)果表明，表觀遺傳機(jī)制是Th細(xì)胞分化和功能的關(guān)鍵因素。盡管與小鼠相比，人類IFNG基因缺乏脫甲基化，分化的人類Th細(xì)胞CpG甲基化分析顯示出與小鼠類似的結(jié)果。將化學(xué)物誘導(dǎo)的小鼠T細(xì)胞分化的表觀遺傳學(xué)改變數(shù)據(jù)外推到人應(yīng)要謹(jǐn)慎。

2.5其他終點(diǎn)從鼠類模型或單一基因的表觀遺傳學(xué)的某些成果已被外推于人類疾病原因。表觀遺傳學(xué)基礎(chǔ)的表型被認(rèn)為是人類疾病的起源有待進(jìn)一步的研究，特別是確定表觀遺傳的正常變異和評價表觀遺傳影響需要適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和對照。已經(jīng)提出，內(nèi)分泌干擾物的表觀遺傳毒性可能導(dǎo)致暴露人群的許多發(fā)育，代謝和行為障礙。對其他靶器官或終點(diǎn)的表觀遺傳毒性還有待研究。

2.6檢測流程和模型Szyf2007年對檢測表觀遺傳毒性提出的研究思路為:①在生命一個時間點(diǎn)的環(huán)境暴露可能會改變表觀遺傳編程，導(dǎo)致穩(wěn)定改變表型和反應(yīng)性，②毒物暴露可能導(dǎo)致表觀遺傳重編程，導(dǎo)致生命后期表型的變異。Reamon-Buettner和Borlak提出使用動物模型(如鼠類)環(huán)境暴露后分析表觀遺傳機(jī)制的研究方案，見圖1。已推薦了檢測表觀遺傳毒性的動物模型，特別是Avy小鼠和Axin1融合(Axin1Fu)小鼠能用于研究表觀遺傳學(xué)和發(fā)育畸形之間的聯(lián)系，因?yàn)樵谔囟ǖ腄NA甲基化模式的改變可以與小鼠遺傳疾病廣泛鏈接。

3ILSI的“評估表觀遺傳變化”研討會

2009年10月ILSI的健康與環(huán)境科學(xué)研究所(IL-SI/HESI)主辦“評估表觀遺傳變化”研討會，評估和提高表觀遺傳學(xué)方面的科學(xué)知識基礎(chǔ)及其在疾病中的作用，包括跨代的表觀遺傳變化的影響，還討論了將表觀遺傳納入安全性評價的幾個問題。

3.1可能用于評價化學(xué)物產(chǎn)生表觀遺傳毒性的模型系統(tǒng)大鼠和/或兔可能是評價外源化學(xué)物產(chǎn)生表觀遺傳變化影響F1和/或F2和F3代的適當(dāng)?shù)哪Ｐ?。小鼠可能是更易于處理的模型，因?yàn)樾∈蠡蚪M有更多的數(shù)據(jù)，并已有用于檢測表觀遺傳變化的工具。已建議Avy小鼠模型作為潛在的篩查工具，其毛色受亞穩(wěn)Avy等位基因IAP隱蔽啟動子附近CpGs甲基化狀態(tài)的影響。然而，Avy小鼠模型用于篩選可能過于敏感。其他可能的模型包括斑馬魚和秀麗隱桿線蟲，以及蜜蜂和果蠅。體外模型是使用哺乳動物細(xì)胞或利用干細(xì)胞。干細(xì)胞包括其他物種不存在的印跡基因。印跡基因有可能作為確定表觀遺傳改變的感應(yīng)器。以上討論的模型有可能用于潛在危害識別，并提供機(jī)制基礎(chǔ)。然而，將很難直接解釋這些數(shù)據(jù)對整體動物和人類的意義。在表觀遺傳模型轉(zhuǎn)化為管理決策測試之前，需要進(jìn)行大量的基礎(chǔ)工作和驗(yàn)證研究。

3.2可能評價的終點(diǎn)/靶對于表觀遺傳變化的指標(biāo)，應(yīng)確定適應(yīng)反應(yīng)還是有害反應(yīng)。確定表觀遺傳修飾與可能提示特定有害影響的疾病相關(guān)基因表達(dá)改變之間的因果關(guān)系或強(qiáng)的關(guān)聯(lián)需要表型錨定。在發(fā)現(xiàn)受影響的表觀遺傳效應(yīng)的基因與某種疾病相關(guān)的基礎(chǔ)上，應(yīng)建立由表觀遺傳機(jī)制調(diào)控的基因數(shù)據(jù)庫。表觀遺傳效應(yīng)很可能有物種，組織，暴露和時間特異性。目前，在研究中實(shí)驗(yàn)對照組是化合物反應(yīng)表觀遺傳變化的最適當(dāng)?shù)膮⒄?，建立表觀遺傳印跡的參考對照范圍可能是有意義的，因?yàn)檫@些區(qū)域甲基化模式可能更趨于穩(wěn)定和遺傳。

3.3可能應(yīng)用的技術(shù)關(guān)于DNA甲基化和miRNA，以陣列為基礎(chǔ)的平臺，針對人類和小鼠樣品已優(yōu)化。針對大鼠可用的工具有限，但可用根據(jù)大鼠基因組序列基于陣列的高通量方法。雖然硫酸氫鹽為基礎(chǔ)的測序評價DNA甲基化方法可用于所有物種，但需要發(fā)展高通量測序方法。區(qū)分異常信號和背景信號并不容易，最大的挑戰(zhàn)將是數(shù)據(jù)分析和解釋，應(yīng)發(fā)展信息學(xué)。

3.4管理機(jī)構(gòu)的觀點(diǎn)為了將表觀遺傳毒性納入風(fēng)險評定，有很多的考慮。必須明確的問題，理解環(huán)境、營養(yǎng)和/或藥物暴露對個人，群體及跨代水平的公共健康的潛在長期影響，界定希望解決的問題，確定模型系統(tǒng)。這就需要努力使與有害結(jié)局和基線改變相聯(lián)系的研究設(shè)計(jì)、方法和模型標(biāo)準(zhǔn)化。以適當(dāng)?shù)膮⒖蓟衔铩⑼緩胶蛣┝框?yàn)證該模型。模型試驗(yàn)檢測的任何變化必須以合理的方式鏈接到表型或臨床結(jié)局。對于法規(guī)測試，方法必須標(biāo)準(zhǔn)化，具有重復(fù)性和重現(xiàn)性。為了將表觀遺傳數(shù)據(jù)有效地納入人類風(fēng)險評定，最好與管理機(jī)構(gòu)共同努力，確定一個正常基線范圍，并與有害結(jié)局關(guān)聯(lián)，界定公共衛(wèi)生關(guān)注的適當(dāng)水平。管理機(jī)構(gòu)將需要開發(fā)分析工具，以對公共健康方面的數(shù)據(jù)進(jìn)行解釋，并將此類數(shù)據(jù)應(yīng)用于風(fēng)險評定模式和慢性健康結(jié)局。

4小結(jié)

關(guān)注外源化學(xué)物引起表觀遺傳學(xué)變化可能產(chǎn)生的有害健康影響具有重要的意義。本文初步提出表觀遺傳毒性和由表觀遺傳學(xué)改變中介的毒性的概念，主要介紹了外源化學(xué)物的表觀遺傳毒性的研究現(xiàn)況和與納入安全性評價的ILSI的討論。為更好地理解表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域及其與安全評估的關(guān)系，應(yīng)重視識別表觀遺傳毒性的毒理學(xué)研究的終點(diǎn)、發(fā)展實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃蛯Y(jié)果的解釋，并將此類數(shù)據(jù)應(yīng)用于風(fēng)險評定模式。這些努力有可能形成新興的科學(xué)領(lǐng)域———表觀遺傳毒理學(xué)(epigenotoxicology)。