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【摘要】骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）作為龐大干細(xì)胞家族中的一名重要成員，具有極強(qiáng)的自我更新復(fù)制、增殖和多向分化的生物特性。20世紀(jì)以來(lái)，科學(xué)家利用BMSCs的這些生物特性，將其用于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)科研和臨床應(yīng)用中的研究已經(jīng)越來(lái)越廣泛，并且也取得重要進(jìn)展。本文就BMSCs的生物特性、分離培養(yǎng)、基礎(chǔ)科研和臨床應(yīng)用等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，重點(diǎn)介紹了BMSCs在骨科疾病、心血管科疾病、肝硬化以及椎間盤(pán)退變等治療方面的研究，通過(guò)對(duì)這些治療方案與技術(shù)的回顧，進(jìn)一步探討B(tài)MSCs在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)以及臨床治療領(lǐng)域的用途，為深入BMSCs的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)科研和臨床應(yīng)用方法提供一定的參考。

【關(guān)鍵詞】骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；誘導(dǎo)分化；分離培養(yǎng)；臨床應(yīng)用；基礎(chǔ)研究；綜述

前言

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BoneMarrowMesenchymalStemCells,BMSCs）的研究越來(lái)越深入，開(kāi)始進(jìn)入了白熱化的過(guò)程，BMSCs在基因、組織工程和臨床治療上的應(yīng)用也應(yīng)運(yùn)而生，這為BMSCs的基礎(chǔ)研究及其臨床疾病治療方法提供了新的思維［l］。BMSCs作為一種中胚層干細(xì)胞，具有極強(qiáng)的自我更新以及增殖分化的潛能，是干細(xì)胞家族中的重要成員［2］。因BMSCs具有免疫源性低、方便取材、來(lái)源廣泛、無(wú)道德倫理問(wèn)題的限制、易于工業(yè)化制備等優(yōu)點(diǎn)，在組織工程的研究中被認(rèn)為是最為理想的種子細(xì)胞，常常被應(yīng)用于細(xì)胞組織移植、基因治療等領(lǐng)域的研究［3］。通過(guò)將BMSCs與細(xì)胞移植、基因治療等技術(shù)結(jié)合起來(lái)，為科研與應(yīng)用創(chuàng)造出了不少新的成果，也為將來(lái)進(jìn)行BMSCs移植以及臨床治療提供了有效的經(jīng)驗(yàn)與手段。

lBMSCs的生物特性

BMSCs在干細(xì)胞家族中，是一類(lèi)能夠從骨髓中分泌出多種不同類(lèi)型細(xì)胞因子的原始骨髓基質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)是能夠在培養(yǎng)的過(guò)程中展現(xiàn)出強(qiáng)大的自我更新、高度的增殖分化能力的細(xì)胞群體。BMSCs的主要來(lái)源是骨髓，但在組織器官中也能獲取，同時(shí)，它具有基質(zhì)細(xì)胞的特性，具有支持造血的功能，在不同的培養(yǎng)條件下，能夠高度增殖分化，并且通過(guò)誘導(dǎo)可以分化成骨、軟骨、脂肪、肌肉、神經(jīng)等組織細(xì)胞［4］。對(duì)于正常的BMSCs，可設(shè)置不同的誘導(dǎo)環(huán)境，能夠?qū)⑵湔T導(dǎo)分化成破骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等，并可使其在多種細(xì)胞系中轉(zhuǎn)化［5-6］。BMSCs強(qiáng)大的自我更新和高度增殖能力，能夠使得原代BMSCs在接種24h內(nèi)貼壁并呈集落狀生長(zhǎng)，集落交界處隨著細(xì)胞生長(zhǎng)，會(huì)出現(xiàn)重疊、融合，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，BMSCs會(huì)繼續(xù)增殖生長(zhǎng)，并在增殖傳代至第二代及之后，呈現(xiàn)為長(zhǎng)梭形的細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)，并呈單層排列方向繼續(xù)生長(zhǎng)［7］。基于BMSCs的這些生物學(xué)特點(diǎn)，其基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究及其轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究已經(jīng)成為當(dāng)前國(guó)際上備受關(guān)注的領(lǐng)域之一，并能夠在臨床治療和基礎(chǔ)研究中發(fā)揮重要作用［8-l0］。

2BMSCs的分離提取與鑒定

在完成每一項(xiàng)與BMSCs相結(jié)合的組織工程研究過(guò)程中，都需要具備數(shù)量充足的BMSCs。雖然BMSCs主要來(lái)源于骨髓，但其存在于骨髓中的含量極少，且所占單個(gè)核細(xì)胞中的比例也僅不到十萬(wàn)分之一［ll］。從哺乳動(dòng)物的骨髓中分離和提取BMSCs的過(guò)程非常難，BMSCs的數(shù)量也會(huì)隨著動(dòng)物的年齡增長(zhǎng)而逐漸減少。因此，要獲取充足數(shù)量的BMSCs必須獲得高純度、高活性以及生物性能均一的體外分離培養(yǎng)、擴(kuò)增技術(shù)［ll-l2］。當(dāng)前，主要有4種較為常用的體外分離、提純BMSCs的方法，包括全骨髓貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀分選法、免疫磁珠法。其中前兩種方法操作較為簡(jiǎn)易、快捷，提取出來(lái)的細(xì)胞純度較高，且實(shí)用性強(qiáng)，對(duì)細(xì)胞活性的影響也較小，是較為理想的分離純化方法［l3-l4］。而后兩種則由于其操作復(fù)雜、價(jià)格昂貴、實(shí)用性不強(qiáng)且對(duì)細(xì)胞活性影響較大，往往不作為最佳的分離純化方法［3,l5］。近幾年來(lái)，在BMSCs的提取純化上，有學(xué)者研究細(xì)胞篩選法以及紅細(xì)胞裂解法對(duì)細(xì)胞BMSCs進(jìn)行提取以及純化。于發(fā)美［l2］在研究中發(fā)現(xiàn)，根據(jù)細(xì)胞的大小來(lái)進(jìn)行分離的細(xì)胞篩選法，是通過(guò)3μm孔徑大小的培養(yǎng)皿，將BMSCs從骨髓中篩選出來(lái)。這一方法具有操作簡(jiǎn)易、生物特性均一的優(yōu)點(diǎn)。而Peterbauer-Scherb等［l6］則發(fā)現(xiàn)，通過(guò)向骨髓液中加入紅細(xì)胞裂解液，能夠?qū)⒐撬枰褐兴拇罅考t細(xì)胞進(jìn)行裂解，隨后再在全骨髓貼壁篩選法的基礎(chǔ)上進(jìn)行提取與純化，減少貼壁的紅細(xì)胞及血小板數(shù)量，為BMSCs提供更多的空間，從而提高純化BMSCs的效率，獲得純度更高的BMSCs。從骨髓中提取的BMSCs雜合了多種細(xì)胞的細(xì)胞群，即使來(lái)源一致，但無(wú)法明確所提取的細(xì)胞中BMSCs所占比例。因此，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)BMSCs做鑒定是極其必要的。目前，BMSCs的鑒定內(nèi)容主要包括對(duì)其形態(tài)學(xué)特征、表面抗原、超微結(jié)構(gòu)及多向分化能力等的檢驗(yàn)［l6］。BMSCs是一種貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，形態(tài)為長(zhǎng)梭形，并且具有很強(qiáng)的增殖能力［l7］。現(xiàn)在有很多研究報(bào)道，BMSCs的表面抗原標(biāo)志具有非專(zhuān)一性的特征，主要包括了CDl06、CD34、CD36、CD7l、CD29等，但是到目前為止，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)具有BMSCs特異性的表面抗原標(biāo)志［l8-2l］。

3BMSCs的臨床治療研究

3.lBMSCs在骨科疾病治療中的研究

骨折、股骨頭壞死，軟骨缺損等疾病是骨科中最常見(jiàn)的病種，盡管目前治療這些疾病的技術(shù)方法日新月異，但治療后的效果仍然不能讓人十分滿(mǎn)意，且費(fèi)用偏高［22］。由于BMSCs具有取材方便、來(lái)源廣泛、增殖分化能力極強(qiáng)等特點(diǎn)，同時(shí)BMSCs對(duì)于軟骨、肌腱、以及骨的修復(fù)和再生等方面有強(qiáng)大的作用［23］，因此BMSCs在骨科疾病的治療上具有廣大的應(yīng)用前景。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外不少專(zhuān)家學(xué)者和骨科醫(yī)生，用自體BMSCs作為種子細(xì)胞與其他材料相結(jié)合，共同植入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，并應(yīng)用于臨床治療軟骨缺損、脊神經(jīng)損傷、股骨頭壞死等骨科疾病，并取得很多成果［2,24］。例如，Tali等［25］將人BMSCs作為主要的修復(fù)材料，利用組織工程技術(shù)將BMSCs種植于具有生物活性的材料上，體外培養(yǎng)構(gòu)建出成軟骨，再將其植入裸鼠體內(nèi)，最終得到了理想的軟骨效果。Kim等［26］也利用BMSCs的生物特性，把人BMSCs和提前礦化好的絲支架結(jié)合起來(lái)，組建形成組織工程骨并進(jìn)行體外培養(yǎng)，結(jié)果顯示人BMSCs能夠在絲支架上發(fā)生良好的增殖和成骨分化。利用BMSCs作為骨組織缺損修復(fù)材料的方法，不僅能夠避免修復(fù)材料在生物源性上的缺陷，也能夠制備出具有良好生物相容性、骨傳導(dǎo)性的支架，促進(jìn)骨缺損的修復(fù)［27］。關(guān)節(jié)軟骨被覆在關(guān)節(jié)表面，具有減震、潤(rùn)滑以及緩解壓力等重要作用，但其自身組織缺乏血運(yùn)，一旦出現(xiàn)缺損，其自愈能力十分有限［28］。BMSCs因其增殖分化能力極強(qiáng)，國(guó)外研究者Caplan等［29］利用適當(dāng)數(shù)目的自身BMSCs移植到支持載體上，將其制作成全層軟骨損傷模型，并將其植入兔的膝部股骨踝處，經(jīng)數(shù)周后的檢測(cè)和觀察發(fā)現(xiàn)，新合成的關(guān)節(jié)軟骨長(zhǎng)出，并且達(dá)到修復(fù)損傷的效果。股骨頭壞死（ONFH）是目前骨科中常見(jiàn)的疾病，隨著研究的發(fā)展，許多結(jié)果都顯示，BMSCs的復(fù)制能力在治療ONFH的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用［30］。Li等［3l］在其實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，同時(shí)對(duì)PPARc進(jìn)行下調(diào)，對(duì)CGRP進(jìn)行上調(diào)，對(duì)于抑制BMSCs的脂肪增殖以及其骨形成是有促進(jìn)作用的，這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于預(yù)防ONFH是一種新的方法。除此之外，利用BMSCs進(jìn)行移植治療骨折不愈合與傳統(tǒng)治療方法相比也頗具優(yōu)勢(shì)。Hernigou等［32］研究者通過(guò)將BMSCs進(jìn)行濃縮移植技術(shù)，對(duì)骨折不愈合患者進(jìn)行治療，結(jié)果獲得成功。

3.2BMSCs在心腦血管疾病治療中的研究

隨著人們消費(fèi)水平的提高以及生活方式的改變，心腦血管疾病的發(fā)病率也不斷增加。目前，BMSCs治療心腦血管疾病的效果也開(kāi)始得到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及臨床實(shí)驗(yàn)的證實(shí)?？茖W(xué)家們利用BMSCs的生物特性，針對(duì)心腦血管疾病對(duì)受損組織進(jìn)行再生性治療、增強(qiáng)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌、分化，且在這一領(lǐng)域獲得一定的效果［33-34］。有研究者在2009年的一項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)中，將BMSCs以靜脈注射的方式對(duì)急性心肌梗死的患者進(jìn)行治療，結(jié)果并沒(méi)有顯示并發(fā)癥，且癥狀有所緩解［35］。Bang等［36］把BMSCs移植到缺血腦卒中患者體內(nèi)，并將這些患者隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，最終的試驗(yàn)結(jié)果為支持BMSCs提供移植治療腦血管疾病提供了有力數(shù)據(jù)。除此之外，德國(guó)羅斯托克大學(xué)醫(yī)學(xué)院成功利用BMSCs的細(xì)胞療法，為一名心肌梗死患者進(jìn)行了靜脈輸注自體BMSCs治療，術(shù)后該患者心功能得到明顯改善［37］。這些成功的試驗(yàn)研究成果為BMSCs治療心血管疾病提供了數(shù)據(jù)支持，并促進(jìn)干細(xì)胞在臨床治療的研究不斷深入。

3.3BMSCs在肝硬化治療上的研究

肝硬化是臨床常見(jiàn)的一種由不同病因引起的良性終末肝病，它的治療原則是保存殘存肝部的支持治療，最理想的治療方法是肝臟移植，然而肝臟移植的來(lái)源十分有限，且價(jià)格昂貴［38］。采取自體BMSCs移植治療則是一種新興的治療手段，為肝硬化病人帶來(lái)新的希望［39］。BMSCs經(jīng)過(guò)純化分離后，將其移植入肝臟，在誘導(dǎo)因子的作用下，能夠繼續(xù)分化形成具有功能的肝細(xì)胞，這些分化所得的肝細(xì)胞為肝硬化治療提供了一種新的途徑。Jung等［40］通過(guò)臨床試驗(yàn)證明了BMSCs對(duì)改善患者凝血功能、降低膽紅素以及增加近期生存率有一定的促進(jìn)作用，這就說(shuō)明BMSCs是肝臟移植的理想種子細(xì)胞。劉黎等［4l］也同樣在臨床治療上使用了自體BMSCs移植的方法，通過(guò)自體骨髓分離純化提取BMSCs，經(jīng)肝動(dòng)脈移植治療的l9例肝硬化患者中，有l(wèi)4例癥狀明顯改善，獲得良好的療效。Peng等［42］將527例肝硬化患者進(jìn)行分組對(duì)照研究，通過(guò)自體BMSCs移植最終獲得良好的近期效果，且并未出現(xiàn)明顯的副作用。

3.4BMSCs在椎間盤(pán)退變治療上的研究

椎間盤(pán)退變是一種常見(jiàn)的臨床疾病，病情嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致下腰痛進(jìn)而影響到患者的日常生活。傳統(tǒng)的治療方法雖然在一定程度上能夠緩解椎間盤(pán)退變所造成的的腰痛，但因其局限性，會(huì)發(fā)生諸多并發(fā)癥。細(xì)胞治療的方法已經(jīng)逐漸被廣泛研究，其中以BMSCs為種子細(xì)胞進(jìn)行治療的臨床研究已取得巨大飛躍［43-44］。有研究證明，BMSCs在某一特定支架上進(jìn)行培養(yǎng)，4周后膠原-II的數(shù)量明顯增多，這為BMSCs修復(fù)椎間盤(pán)纖維環(huán)提供了數(shù)據(jù)支持［45］。20l0年Yoshikawa等［46］首次通過(guò)自體BMSCs移植進(jìn)行椎間盤(pán)再生治療，患者在術(shù)后腰腿疼痛緩解，2年后通過(guò)醫(yī)學(xué)影像技術(shù)進(jìn)行檢查，發(fā)現(xiàn)其髓核內(nèi)真空現(xiàn)象消失，且沒(méi)有不良反應(yīng)。國(guó)外學(xué)者Orozco等［47］也使用同樣的方法對(duì)l0例患者進(jìn)行了移植治療，結(jié)果顯示其中9例患者的癥狀得到改善與緩解。通過(guò)組織工程與BMSCs相結(jié)合的方式，為移植治療椎間盤(pán)退變提供了新的治療手段，是促進(jìn)細(xì)胞療法深入研究與發(fā)展的重要推動(dòng)力。

4BMSCs的基礎(chǔ)應(yīng)用研究

除了將BMSCs應(yīng)用于臨床疾病治療，近些年來(lái)，BMSCs在組織工程、誘導(dǎo)分化、表觀遺傳調(diào)控和細(xì)胞轉(zhuǎn)化等方面的基礎(chǔ)科研也有不少的研究成果。隨著對(duì)BMSCs的了解與研究，人們已經(jīng)能夠利用其誘導(dǎo)分化成成軟骨的生物特性應(yīng)用于組織工程中［48］。例如Yan等［49］將絲素蛋白和納米碳酸鈣層進(jìn)行結(jié)合，構(gòu)建出新型的多孔雙層支架，并將兔BMSCs種植到支架內(nèi)，共同植入兔膝關(guān)節(jié)缺損處，數(shù)周后觀察發(fā)現(xiàn)復(fù)合支架與骨組織緊密貼合，并可見(jiàn)大量軟骨下骨向內(nèi)生長(zhǎng)并有血管生成，說(shuō)明該雙層支架對(duì)于軟骨缺損有修復(fù)作用。BMSCs也能夠作為種子細(xì)胞，利用其誘導(dǎo)分化的生物特性，創(chuàng)造一定的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件，促進(jìn)缺損牙槽骨的修復(fù)。據(jù)報(bào)道，將BMSCs與富血小板血漿、纖維蛋白膠等共同進(jìn)行體外培養(yǎng)，數(shù)周后所形成的膜片對(duì)于牙槽骨缺損修復(fù)具有良好的效果［50-52］。因BMSCs具有的多向分化能力，利用其分化干細(xì)胞也在臨床應(yīng)用中越來(lái)越多，使得BMSCs在細(xì)胞替代治療和基因治療中的價(jià)值不斷凸顯。有研究報(bào)道，通過(guò)某些營(yíng)養(yǎng)因子能夠利用其抗氧化作用調(diào)節(jié)BMSCs增殖相關(guān)的基因表達(dá)量，以促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)元和血管內(nèi)皮細(xì)胞等的分化［53］。除此之外，表觀遺傳學(xué)對(duì)BMSCs的調(diào)控作用，也會(huì)使得BMSCs在骨、神經(jīng)、肌肉、血管等損傷修復(fù)方面的作用受到影響［54］。BMSCs在細(xì)胞工程、組織工程以及基因工程上的研究應(yīng)用已經(jīng)成為熱點(diǎn)，將極大地促進(jìn)再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，為臨床醫(yī)學(xué)帶來(lái)巨大的應(yīng)用價(jià)值。

5問(wèn)題與展望

如今，BMSCs相關(guān)的基礎(chǔ)科學(xué)研究以及臨床應(yīng)用正在醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)的領(lǐng)域中大放光彩，關(guān)于BMSCs的研究也有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。無(wú)論在細(xì)胞基因?qū)用娴恼{(diào)控，亦或是對(duì)疾病的預(yù)防和治療，BMSCs在不斷地用各種形式幫助人們攻克難題、創(chuàng)新技術(shù)。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于BMSCs在組織工程支架的研究不斷深入，通過(guò)將BMSCs與細(xì)胞基因、組織工程相結(jié)合，能夠制備出理想的細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境，幫助BMSCs在體外三維生物微環(huán)境中進(jìn)行增殖分化，調(diào)控基因表達(dá)，促進(jìn)BMSCs的增殖分化，為臨床治療方法提供更大的動(dòng)力與來(lái)源。盡管目前人們對(duì)于BMSCs的研究獲得了很大的進(jìn)展，但在BMSCs的分離純化、鑒定方面仍然不夠理想，未能完全篩選出BMSCs特有的標(biāo)志分子，并且還需要建立一套完整的鑒定和培養(yǎng)BMSCs的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。因此，在實(shí)際的臨床應(yīng)用時(shí)還存在一定的難度。相信隨著研究方法的不斷探索與更新，這些問(wèn)題會(huì)得到解決，BMSCs作為醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)領(lǐng)域的理想種子細(xì)胞，將會(huì)為臨床多類(lèi)疾病的治療提供廣大的應(yīng)用前景。

作者：李婷 陳莉智 黃文華 單位：南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)國(guó)家重點(diǎn)學(xué)科