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自1992年卵胞漿內單精子注射（ICSI）［1］問世以來，實現了男性少、弱，畸形精子癥患者獲得遺傳學后代的愿望，1993年Schoysman等［2］報道了無精子癥患者應用睪丸精子行ICSI獲得成功。此后，經皮附睪抽吸（PESA）、睪丸切開（TESE）行ICSI已作為有正常生精的梗阻性無精（OA）或睪丸衰竭的非梗阻性無精（NOA）及不射精患者常規治療方法。臨床上，無精子癥患者在排除遺傳性疾病的基礎上一般首先要進行附睪或睪丸的診斷性活檢，其參數可預測附睪或睪丸內是否有精子。為了避免在其后的ICSI周期中反復的睪丸手術造成的血行阻斷和可能的永久性損害，可以將前期診斷性睪丸活檢獲取的精子或ICSI治療周期所剩余的微量活精子進行冷凍保存，然后擇期行ICSI治療。本研究回顧性分析了本中心進行的冷凍附睪或睪丸精子復蘇后行ICSI治療的有效性，并與新鮮睪丸精子相比較。

1、資料與方法

1.1一般資料回顧性分析了2007年9月~2008年1月應用冷凍復蘇后的附睪、睪丸精子行ICSI5個周期（4PESA，1TESE），新鮮附睪、睪丸精子行ICSI41個周期（27PESA，14TESE），共46個周期。46對男性梗阻性無精的不育夫婦中2例為不射精，11例為先天性輸精管缺如，6例為附睪結核，1例先天性右側輸精管缺如伴左側隱睪，其余均為原因不明的無精子癥。確定無精至少需3次射出的精液標本離心處理并檢測沉淀。

1.2卵巢刺激給予長效促性腺激素釋放激素類似物（GnRH-a）抑制垂體，重組促性腺激素（FSH）刺激卵巢，誘導多個卵泡生長，B超監測卵泡發育情況，當至少有2個優勢卵泡直徑達到17mm后，停用GnRH-a和FSH；予以絨毛膜促性腺激素（HCG）5000~10000IU肌注后32～36h后，在B超引導下經陰道穹隆穿刺取卵。去除卵冠丘復合物外的顆粒細胞，MⅡ期成熟卵子待行ICSI。

1.3精子的獲取PESA：局部麻醉下，患者采取仰臥位，常規消毒，鋪巾，將附睪固定于陰囊皮下，用已預先抽進少量培養液的1mlBD注射器于肉眼直視下穿刺附睪頭并負壓抽吸，直至針管內有淡黃色混濁附睪液體抽出。如未見液體抽出，則改變穿刺點。將附睪液注入培養皿，在倒置顯微鏡下尋找活動精子。如鏡下未見活動精子，則再次穿刺取精或行對側附睪穿刺，若仍無精子，則考慮TESE法取精。TESE：局部麻醉下，在陰囊皮膚做一個小切口，穿過腹膜鞘膜在白膜上做一個或多個小切口，切取一塊睪丸組織放入1006培養液（美國Quinns產品）中，室溫下保持15min，洗滌2次，在解剖顯微鏡下用兩個無菌BD注射器將睪丸組織撕碎，在倒置顯微鏡下檢驗一滴懸液，檢測有無精子。

1.4精子懸液的制備和冷凍檢測到活動精子的附睪懸液或睪丸組織懸液，加入到含3ml1006培養液Falcon試管中，2次離心（600g，5min），棄上清，加入0.1ml1006培養液，稀釋混勻。放入37℃5.5%CO2培養箱內孵育（注意緊蓋），待行ICSI。如ICSI后所剩余精子數目足以再行ICSI，則將剩余精子加以冷凍；診斷性活檢則將精子2次離心洗滌處理后直接冷凍。將精子冷凍保護液8020（美國Quinns產品）和精子懸液按體積1∶1比例混勻，分裝入冷凍管中，在液氮氣相中暴露15min，最后投入液氮冷凍保存。

1.5冷凍精子復蘇和ICSI取卵日有成熟卵子即可復蘇附睪或睪丸冷凍精子，從液氮中取出冷凍管，迅速將其投入37℃水浴中5min，后用1006培養液離心洗滌2次（600g，5min），沉淀用0.1ml1006培養液混勻，放入37℃5.5%CO2培養箱內孵育1h（注意緊蓋），在倒置顯微鏡下檢驗一滴復蘇的懸液，檢測有無活動精子。有活動精子在取卵后4h行ICSI。

1.6受精、胚胎評估和胚胎移植ICSI后18h觀察受精，正常受精可觀察到雙原核和兩個清晰或碎裂的極體，后24h、48h觀察胚胎分裂情況，取卵后第3天選擇優質胚胎移植，移植后14天檢測HCG，如陽性，則為生化妊娠，再于移植后35天測血β-HCG升高，B超檢查顯示妊娠囊、見胎心搏動則為臨床妊娠。

1.7統計學方法采用SPSS軟件對數據進行統計學分析，計量資料用t檢驗，計數資料用χ2檢驗，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2、結果

回顧性分析了46對男性梗阻性無精的不育夫婦，共46個促排卵周期，行冷凍復附睪或睪丸精子ICSI5個周期（4PESA，1TESE），行新鮮附睪或睪丸精子ICSI41個周期（27PESA，14TESE）。凍精組男性平均年齡為（32.2±5.2）歲，女性平均年齡為（30.0±5.0）歲；對照組男性平均年齡為（32.5±5.4）歲，女性平均年齡為（30.0±5.3）歲。見表1。對比兩組ICSI的受精率、卵裂率和優胚率，未顯示有統計學差異（P>0.05）。凍精組共移植5個周期，妊娠4例，繼續妊娠3例，宮外孕1例；對照組共移植39個周期，放棄移植2個周期（1個為未卵裂，1個為患者有OHSS高風險），妊娠17例，繼續妊娠15例，流產2例。凍精組臨床妊娠率和胚胎種植率明顯高于對照組，但差異亦無統計學意義（P>0.05），見表2。表1凍精組、對照組患者的一般情況表2凍精組、對照組的ICSI參數和臨床結局新晨

3、討論

新鮮附睪或睪丸精子行ICSI被廣泛地應用于無精子癥患者，使更多的無精子癥患者擁有了自己的遺傳學后代。然而這項技術主要缺點之一就是每一次ICSI操作都需要外科手術取精，大部分的不孕夫婦仍需行多個取卵和ICSI周期才會受孕，這不僅給患者帶來麻煩，還會損害附睪和睪丸［3］。為了解決這個問題，近些年來，診斷性活檢時冷凍附睪或睪丸精子后復蘇行ICSI逐漸應用于臨床，而且取得了與新鮮附睪或睪丸精子ICSI周期相近的臨床結果［4，5］。我們是2007年7月初探PESA精子冷凍，8月初探TESE精子冷凍，并于2007年9月獲得第1例TESE精子冷凍復蘇后ICSI的臨床妊娠，2007年10月獲得第1例PESA精子冷凍復蘇后ICSI的臨床妊娠。本資料回顧性分析了診斷性附睪或睪丸活檢冷凍精子復蘇后行ICSI治療的有效性及妊娠結局，結果顯示冷凍復蘇的附睪或睪丸精子行ICSI所得受精率、卵裂率、優質胚胎率、妊娠率和種植率與使用新鮮附睪或睪丸精子行ICSI相比沒有統計學差異（P＞0.05），這與Gianaroli等［6］報道一致。盡管有報道證實［7］，附睪或睪丸精子的冷凍復蘇會對精子造成胞漿空泡增多，細胞核和胞質膜皺縮或水腫、膜斷裂、頂體等損害，但冷凍也間接起到了一種篩選的作用，清除了大部分有缺陷的精子，只有那些活動力較好、膜功能穩定、代謝旺盛、染色體正常的精子才能經受住低溫而得以保全，這種選擇，解釋了本研究凍精組臨床妊娠率和種植率高于對照組的結果，但本研究也與一些文獻報道相反［8］，考慮是否與樣本較少有關，還需增大樣本來進一步證實。冷凍并沒有降低精子的發育潛能，使用冷凍附睪或睪丸精子ICSI的結果是可以接受的。ICSI治療周期前行診斷性睪丸活檢并凍存附睪或睪丸精子是可行和有效的，一方面增加了新鮮睪丸組織的利用率，最大限度地保留了患者的遺傳物質［9，10］，另一方面也減輕了反復外科手術取精給患者帶來的精神和經濟負擔，有效地防止了在取卵當日因外科手術取精失敗而放棄本周期治療的發生。