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【摘要目的摘要：探索骨橋蛋白（OPN）在人腦膠質(zhì)瘤中的功能、表達(dá)及其意義.方法摘要：采用RTPCR及免疫組化染色方法檢測腦膠質(zhì)瘤組織和正常組織中骨橋蛋白.結(jié)果摘要：骨橋蛋白在膠質(zhì)瘤組織細(xì)胞中表達(dá)，而在正常腦組織細(xì)胞中無表達(dá)，而且OPN的表達(dá)濃度和膠質(zhì)瘤惡性程度呈正相關(guān).結(jié)論摘要：人腦膠質(zhì)瘤中OPN的表達(dá)和其惡性程度密切相關(guān).
【神經(jīng)膠質(zhì)瘤；骨橋蛋白；免疫組織化學(xué)
0引言
人腦膠質(zhì)瘤侵襲性生長是術(shù)后復(fù)發(fā)和臨床療效差的主要原因，過程涉及到細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移等多個(gè)環(huán)節(jié).骨橋蛋白（osteopontin,OPN）是一種含有整合素結(jié)合序列GRGDS的分泌型磷酸化酸性糖蛋白，它對(duì)于OPN的黏附功能起重要功能.整合素是OPN的受體，OPN通過細(xì)胞黏附序列GRGDS識(shí)別整合素和細(xì)胞結(jié)合，刺激了細(xì)胞信號(hào)的傳送途徑，促進(jìn)了細(xì)胞的黏附和遷移，促使了細(xì)胞向惡性發(fā)展［1-3］，我們采用免疫組化和RTPCR方法，探索OPN在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá).
1材料和方法
1.1材料
河南省人民醫(yī)院200308/200502手術(shù)切除膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移和正常腦組織標(biāo)本共36例.按WHO病理分級(jí)將膠質(zhì)瘤分為Ⅰ～Ⅳ級(jí)，其中Ⅰ級(jí)6例，Ⅱ級(jí)7例，Ⅲ級(jí)6例，Ⅳ級(jí)4例，轉(zhuǎn)移癌8例，正常腦組織5例.
1.2方法
1.2.1免疫組化染色采用SP染色三步法.SP試劑盒購于美國ZYMED生物技術(shù)公司.按操作說明進(jìn)行各組的OPN免疫組化染色.簡要步驟摘要：30mL/L過氧化氫室溫孵育，DH2O沖洗，PBS浸泡，100mL/L山羊血清封閉；滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗工作液，PBS沖洗；滴加生物素標(biāo)記二抗，PBS沖洗；滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記物，顯色劑(DAB)顯色.陽性對(duì)照用已知OPN表達(dá)陽性的組織切片，陰性對(duì)照用PBS代替一抗，以胞漿/胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕色顆粒為陽性細(xì)胞.
1.2.2總RNA的提取和RTPCR①每0.1g組織中加入1mLTrizol，提取總RNA并按說明書操作.②逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)摘要：總RNA4μg,0.5g/Loligo(Dt)1μL,加入一定量DPEC處理水,使總體積少于15μL，放70℃5min.將反應(yīng)體系立即置冰上，再加入5mmol/LBuffer6μL,10mmol/LdNTP1μL,833.5μkat/LRNAsin0.5μL,3.334mkat/LMMLV1μL,用DPEC處理水定容于30μL.37℃1h,94℃5min.③PCR摘要：將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增.引物是自行設(shè)計(jì)并由上海生物有限公司合成.OPN上游引物序列為5′CTGATGCTACAGACGAGGAC3′(668687)；下游引物序列為5′ACTATCAATCACATCGGAAT3′（912893）；內(nèi)參照G3PDH上游引物序列為5′GGTCGGAGTCAACGGATTGGTCG3′(90113)；下游引物序列為5′CCTCCGACGCCTGCTTCACCA3′(877856).50μL的反應(yīng)體系中加入10mmol/Lbuffer2μL,25mmol/LMgCl210mmol/LdNTP1μL,G3PDH引物各1μL,OPN引物各1μL,83.35μkat/LTaq酶0.5μL,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5μL,加DEPC處理水至50μL.94℃5min預(yù)變性，94℃30s→55℃1min→72℃80s,共30個(gè)循環(huán)，72℃10min,4℃冷卻后-20℃保存.④電泳及定量分析摘要：PCR產(chǎn)物行20g/L瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)分析灰度值，結(jié)果為OPN灰度值/G3PDH灰度值.
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理摘要：各組織相對(duì)積分值以x±s表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間差異比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn).
2結(jié)果
在正常腦組織中(Fig1)未見棕黃色或棕色陽性顆粒，即沒有表達(dá)OPN，而在膠質(zhì)瘤組織(Fig2)細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中以及血管內(nèi)皮細(xì)胞均見棕黃色或棕色陽性顆粒，即表達(dá)OPN.且IV級(jí)膠質(zhì)瘤組織中OPN的表達(dá)要比II級(jí)膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)明顯增加（Tab1）.表1RTPCR檢測OPNmRNA在正常人腦組織和人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)量（略）
3討論
OPN是一種細(xì)胞分泌性蛋白，富含甘氨酸、精氨酸、絲氨酸、天冬氨酸殘基的磷酸化酸性糖蛋白［2］,它首先由骨骼中分離出，在人體免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、炎癥反應(yīng)、癌腫的轉(zhuǎn)移中起重要功能，通過其受體融合素及CD44等促進(jìn)細(xì)胞趨化、黏附、遷移并刺激細(xì)胞信號(hào)的傳送途徑［4-6］，從而促進(jìn)了細(xì)胞的惡性發(fā)展.免疫組化結(jié)果檢測發(fā)現(xiàn)惡性星形細(xì)胞瘤表達(dá)OPN的量較高，而良性星形細(xì)胞瘤和非腫瘤組織表達(dá)OPN的量較低，這些結(jié)果也表明膠質(zhì)瘤細(xì)胞能表達(dá)OPN，且表達(dá)程度和它的惡性程度相關(guān)［1］，而和癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有關(guān)的是OPN中的GRGDS序列通過其受體整合素和細(xì)胞結(jié)合完成對(duì)細(xì)胞的黏附和遷移功能.Takano等［7］認(rèn)為OPN和血管生成有關(guān)，可介導(dǎo)OPNmRNA在血管內(nèi)皮中的表達(dá).
本結(jié)果說明，OPN和膠質(zhì)瘤惡性程度之間及膠質(zhì)瘤和正常腦組織間存在內(nèi)在聯(lián)系，統(tǒng)計(jì)學(xué)上呈明顯的正相關(guān)性.有學(xué)者認(rèn)為，OPN在啟動(dòng)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞素Th1、抑制素Th2的延遲性超敏反應(yīng)中起重要功能，腫瘤的生長經(jīng)常因?yàn)闄C(jī)制缺乏正常的免疫識(shí)別能力和反抗能力來調(diào)節(jié)應(yīng)急反應(yīng)［8］，而OPN可能在這種情形中起到了關(guān)鍵性的功能.而在轉(zhuǎn)移癌中OPN的積分稍低于Ⅲ～Ⅳ級(jí)腦膠質(zhì)瘤中OPN的積分，原因是OPN主要和癌瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及細(xì)胞遷移有關(guān).在轉(zhuǎn)移腫瘤和正常組織交界處表達(dá)比較強(qiáng)，在腫瘤實(shí)質(zhì)中心部分表達(dá)不對(duì)四周腦組織影響，而主要是擠壓和引起腦水腫為主，這也許可以解釋為什么轉(zhuǎn)移癌和腦組織的手術(shù)界限一般比較清楚，且術(shù)后神經(jīng)功能少有缺失，復(fù)發(fā)相對(duì)較少.
有關(guān)OPN在組織細(xì)胞中的陽性表達(dá)，從20世紀(jì)90年代開始，國內(nèi)外很多學(xué)者就對(duì)它和許多組織、細(xì)胞（血管平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞）、腫瘤（人腦膠質(zhì)瘤）的密切關(guān)系進(jìn)行報(bào)道.1996年Bautista等［9］建立了一種血中OPN抗原檢測方法.楊力等［10］觀察到OPN在侵襲轉(zhuǎn)移胃癌中的表達(dá).但是OPN在微血管及內(nèi)皮細(xì)胞中強(qiáng)陽性表達(dá)，而在低級(jí)別的星性細(xì)胞瘤微血管及內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)中的表達(dá)呈弱陽性，正常微血管內(nèi)皮中的陽性表達(dá)，還未見系統(tǒng)的表達(dá).OPN在人腦膠質(zhì)瘤微血管及內(nèi)皮細(xì)胞中強(qiáng)陽性表達(dá)，而在低級(jí)別的星性細(xì)胞瘤微血管及內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)呈弱陽性，正常微血管及內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)不表達(dá)，這和Takano等［7］所認(rèn)為的OPN和血管生成并可介導(dǎo)OPN在微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)、促進(jìn)血管快速生成、刺激內(nèi)皮細(xì)胞的遷移有關(guān).劉智敏等［11］報(bào)道了粘著斑相關(guān)非激酶是血管生成的一個(gè)標(biāo)志，對(duì)膠質(zhì)瘤的遷移有抑制功能.本結(jié)果表明OPN表達(dá)的強(qiáng)弱，是膠質(zhì)瘤血管生成的一個(gè)標(biāo)志，和膠質(zhì)瘤的生成呈正相關(guān).這些實(shí)驗(yàn)和報(bào)道，或許可以證實(shí)，通過抗血管治療，能為抗膠質(zhì)瘤提供一條新的治療途徑.