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1多糖的發(fā)展歷史及其發(fā)展方向

多糖是由多個(gè)單糖基及糖苷鍵相連接而成的高聚物，一般是20個(gè)以上的單糖聚合而成，廣泛存在于動(dòng)物細(xì)胞膜，高等植物和微生物的細(xì)胞壁中，是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一，同維持生命活動(dòng)密切相關(guān)。蛋白質(zhì)、核酸和多糖最重要的三種生物大分子，由于多糖的結(jié)構(gòu)難以控制比蛋白質(zhì)和核酸復(fù)雜得多，再加上人們?cè)缙谥话讯嗵强醋骷?xì)胞結(jié)構(gòu)成分和食物來(lái)源，使得人們對(duì)多糖的研究成為“生物化學(xué)中最后一個(gè)前言”。如100多年前，德國(guó)著名科學(xué)家就開(kāi)始了糖類的研究。目前，以多糖結(jié)構(gòu)、功能和藥用價(jià)值為核心的糖工程被認(rèn)為是繼蛋白質(zhì)工程、基因工程后生物化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域中最后一個(gè)巨大的科學(xué)前沿。

目前，世界各國(guó)政府對(duì)多糖的生物學(xué)研究給予高度重視。1986年美國(guó)能源部資助佐治亞大學(xué)創(chuàng)建了復(fù)合糖研究中心，建立復(fù)合糖數(shù)據(jù)庫(kù)。牛津大學(xué)Dwek教授在1988年提出糖生物學(xué)這個(gè)名詞，這標(biāo)志著糖生物學(xué)這一新的分支學(xué)科的誕生。日本于1989年創(chuàng)辦了《糖科學(xué)與糖工程動(dòng)態(tài)》雜志，出版了專著《糖工程學(xué)》。同年日本政府科學(xué)技術(shù)廳提出“糖工程基礎(chǔ)與應(yīng)用研究推進(jìn)戰(zhàn)略”。1990年E-選凝素的發(fā)現(xiàn)將糖生物學(xué)推向了生命科學(xué)的前沿。歐盟于1994-1998年發(fā)起“歐洲糖類研究開(kāi)發(fā)網(wǎng)絡(luò)”計(jì)劃。糖生物學(xué)的時(shí)代正在加速來(lái)臨，甚至有人預(yù)計(jì)，如同20世紀(jì)，蛋白質(zhì)、膚類、氨基酸與核酸時(shí)代一樣，21世紀(jì)應(yīng)當(dāng)是多糖生命科學(xué)的時(shí)代。

糖類的研究工作和蛋白質(zhì)、核酸的研究工作相比，在我國(guó)還是一個(gè)薄弱的環(huán)節(jié)。我國(guó)在多糖方面的研究始于20世紀(jì)70年代，但近年來(lái)發(fā)展迅速，在全國(guó)第一次糖的生化學(xué)術(shù)會(huì)議后，《糖復(fù)合物的生化研究技術(shù)》出版，標(biāo)志著我國(guó)在糖化學(xué)方面的研究工作已經(jīng)有了一個(gè)較好的開(kāi)端網(wǎng)。1996年我國(guó)將“糖生物學(xué)”列為國(guó)家重點(diǎn)課題。研究的對(duì)象包括植物類、動(dòng)物、真菌類、細(xì)菌、地衣等；研究范圍涉及多糖的分離純化、理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)分析、免疫學(xué)、藥理學(xué)以及臨床應(yīng)用等，其中對(duì)免疫提高作用機(jī)理的研究已經(jīng)深入到分子、受體水平；研究的方法涉及化學(xué)、物理、生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)等諸多領(lǐng)域。我國(guó)地大物博，糖類資源也很豐富，而且有些真菌多糖還對(duì)生物體具有獨(dú)特的生理作用，可以作為藥用資源。

今后一個(gè)時(shí)期內(nèi)，多糖的研究有以下幾個(gè)趨勢(shì)：從單味中藥多糖的研究向中藥復(fù)方多糖體系的研究發(fā)展；從單一免疫系統(tǒng)作用的研究向神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)作用的研究發(fā)展；從藥品向食品、從治療向保健發(fā)展。經(jīng)過(guò)半個(gè)多世紀(jì)的發(fā)展，活性多糖的研究取得了重大進(jìn)展。建立了一系列活性多糖的提取、純化方法、生物活性測(cè)試方法、結(jié)構(gòu)分析方法，發(fā)現(xiàn)了許多具有重要生理活性的多糖，研究的廣度和深度在不斷發(fā)展。隨著多糖化學(xué)和糖生物學(xué)的深入研究，活性多糖將會(huì)進(jìn)入一個(gè)新時(shí)代，將為人類的健康和安全提供更為有力的幫助。

2多糖的研究方法

2.1多糖的來(lái)源

多糖來(lái)源十分豐富，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物（細(xì)菌和真菌）和海藻中（如植物的種子、莖和葉，動(dòng)物粘液，昆蟲及甲殼動(dòng)物的殼真菌，細(xì)菌的胞內(nèi)外等），從動(dòng)植物器官組織、菌類及微生物發(fā)酵產(chǎn)物中可得到不同種類的多糖。按其來(lái)源可分為高等植物多糖、動(dòng)物多糖、微生物多糖、藻類多糖。其中研究較早且最多的是從細(xì)菌中得到的各種莢膜多糖，它在醫(yī)學(xué)上主要用于疫苗。1984年，蘇聯(lián)人在荷蘭召開(kāi)的第十二次國(guó)際碳水化合物討論會(huì)上報(bào)道了用合成特定結(jié)構(gòu)的莢膜多糖作疫苗，引起與會(huì)者的極大興趣，此后有關(guān)真菌多糖的研究逐漸深入和廣泛，如酵母菌多糖、食用菌多糖，特別是食用菌多糖的研究，取得了很大進(jìn)展，其中以香菇多糖研究的較為深入。1969年，日本人千原首次報(bào)道從香菇中分離出一種抗腫瘤多糖，轟動(dòng)了整個(gè)醫(yī)學(xué)、藥學(xué)界，之后掀起一股從食用或藥用真菌中尋找抗腫瘤成分的熱潮。另外，植物多糖的開(kāi)發(fā)也倍受人們的青睞，由于我國(guó)是中藥的起源之地，而糖類是中藥材中普遍存在的成分，在對(duì)各種中藥材的化學(xué)成分研究的過(guò)程中，人們都少不了對(duì)其中多糖的關(guān)注。植物多糖研究得比較深入的是稻草多糖、麥秸多糖、竹多糖、刺五茄多糖。海藻多糖雖然研究得不多，但其前途也是很光明的。到目前為止，已有300多種多糖化合物從天然產(chǎn)物中被分離出來(lái)。

2.2多糖的提取、分離純化

2.2.1多糖的提取

多糖是極性大分子化合物，常用的提取方法有：熱水浸提法、稀堿浸提法、酸浸提法和酶法。前三種為化學(xué)方法，酶法為生物方法。稀酸提取時(shí)，時(shí)間宜短、溫度不宜超過(guò)50℃。一般植物多糖提取多采取熱水浸提法。在提取多糖之前，首先要根據(jù)多糖的存在方式及提取部位的不同，決定在提取之前是否作預(yù)處理。動(dòng)物多糖和微生物的細(xì)胞內(nèi)多糖的組織細(xì)胞多有脂質(zhì)包圍，一般需先加入醇或醚進(jìn)行回流脫脂，釋放多糖，然后依多糖性質(zhì)（如酸堿性、胞內(nèi)或胞壁多糖）再將脫脂后的殘?jiān)捎靡运疄橹黧w的溶劑（冷水、熱水、稀鹽或稀堿水、或熱的稀鹽或稀堿水）等溶液提取。溶劑性質(zhì)、浸提溫度、時(shí)間等均影響提取效果?，F(xiàn)在，提取多糖還多采用酶法，常用的酶有纖維素酶、果膠酶、蛋白酶及其復(fù)合酶。

2.2.2多糖的分離

采用以上方法提取的多糖中常含有無(wú)機(jī)鹽、大分子蛋白質(zhì)、木質(zhì)素、色素及醇不溶的小分子有機(jī)物等雜質(zhì)，必須分別除去，將這些雜質(zhì)除去的過(guò)程，一般稱為多糖的分離。工業(yè)化生產(chǎn)中一般采取透析法、離子交換、凝膠過(guò)濾或超濾法除去這些雜質(zhì)。對(duì)于大分子雜質(zhì)，可用酶法、乙醇、丙酮溶劑沉淀法或絡(luò)合物法除去。

脫蛋白質(zhì).

由于原料組成中均含有一定量的蛋白質(zhì)，因此在多糖的提取工藝中，脫除蛋白質(zhì)是分離多糖的重要步驟。常用的方法有：Sevag法，三氟三氯乙烷法，三氯乙酸法，酶法或酶法與Sevag法結(jié)合，等電點(diǎn)沉淀法。

Sevag法，利用蛋白質(zhì)在氯仿中變性的特點(diǎn)，用氯仿：戊醇=5：1或4：1的二元溶劑體系按1：5加入到多糖提取液中，混合物經(jīng)劇烈振搖后離心，蛋白質(zhì)與氯仿-戊醇生成凝膠物而分離，分去水層和溶劑層交界處的變性蛋白質(zhì)。此法條件溫和，但是效率不高，一般要脫除5次左右方可除盡蛋白質(zhì)。酶法或酶法與Seveg法結(jié)合，用蛋白酶將蛋白質(zhì)水解，再通過(guò)透析、凝膠過(guò)濾或超濾除去，是目前認(rèn)為較好的脫蛋白質(zhì)的方法。

三氟三氯乙烷法，將三氟三氯乙烷按1：1的比例加到多糖提取液中，在低溫下攪拌約10min，離心得上層水層，水層繼續(xù)用上述方法處理幾次即得。此法效率高，但因溶劑沸點(diǎn)低，易揮發(fā)，不能大量使用。

三氯乙酸法，利用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)的原理，用3%-30%三氯乙酸，在低溫下攪拌加入到多糖提取液中，直至溶液不再繼續(xù)混濁為止離心棄沉淀，即可達(dá)到脫蛋白的目的。存在于溶液中的三氯乙酸經(jīng)中和后，通過(guò)透析或超濾等方法除去。此法較為劇烈，會(huì)破壞含呋喃糖殘基的多糖但效率高，操作簡(jiǎn)單，植物多糖多采用此法。

等電點(diǎn)沉淀法，逐步調(diào)節(jié)粗糖溶液pH至酸性（PH=2-5），可以有效除去大部分酸性蛋白質(zhì)。其優(yōu)點(diǎn)是適合于工業(yè)化生產(chǎn)，為防止在酸性條件下某些基團(tuán)或糖普鍵被破壞，宜在低溫下進(jìn)行。

脫色

對(duì)于植物多糖可能會(huì)含有酚類化合物而顏色較深，而從動(dòng)物和微生物等中提取的多糖也會(huì)帶有不同深淺的顏色，對(duì)多糖進(jìn)行脫色處理可使多糖的應(yīng)用范圍更加廣泛。常用的脫色方法有：離子交換法、氧化法、技術(shù)絡(luò)合物法、吸附法（纖維素、硅藻土、活性炭等）。一般情況下，可以用活性炭處理脫色，但活性炭會(huì)吸附多糖，造成多糖損失。DEAE-纖維素是目前最常用的脫色方法，通過(guò)離子交換柱不僅達(dá)到脫色目的，而且可以進(jìn)行多糖的分離。H2O2作為一種氧化脫色劑，濃度不宜過(guò)高且在低溫下進(jìn)行，否則會(huì)引起多糖的降解。

2.2.3多糖的純化

上述經(jīng)過(guò)脫蛋白、脫色和去除小分子雜質(zhì)的提取液是含多種組分的多糖混合物，即是多分散性的。其不均一性表現(xiàn)在化學(xué)組成、聚合度、分子形狀等的不同。要得到單一的多糖組分，還需要進(jìn)行純化。通常采取的純化方法有以下幾種。

（l）分級(jí)沉淀法

利用不同分子量的多糖在不同濃度低級(jí)醇或低級(jí)酮中的溶解性不同的原理，逐步提高溶液中醇或酮的濃度，使不同組分的多糖依分子量由大至小的順序分級(jí)沉淀可達(dá)到純化的目的。

（2）季銨鹽沉淀法

根據(jù)長(zhǎng)鏈季銨鹽能與酸性多糖形成不溶性多糖化合物的特性，以分離酸性和中性多糖常用的季銨鹽是十六烷基三甲基嗅化錢（CTAB）及其堿（CTA-OH）和十六烷基吡啶（CPC）。實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制多糖混合物的pH值小于9且無(wú)硼砂存在，否則中性多糖也會(huì)沉淀出來(lái)。通常CTAB或CPC水溶液的濃度為1%-10%（W/V），在攪拌下滴加于0.1-1%（W/V）的多糖溶液中，這時(shí)酸性多糖即能從中性多糖中沉淀出來(lái)。根據(jù)形成的沉淀能溶于不同的鹽溶液、酸溶液和有機(jī)溶劑中的性質(zhì)，使多糖游離出來(lái)。

（3）離子交換層析法

利用不同多糖分子電荷密度不同，而與離子交換劑中的離子或某些基團(tuán)發(fā)生電性結(jié)合。其親和力隨多糖結(jié)構(gòu)與電離性質(zhì)而異，一般隨著分子中酸性基團(tuán)的增加而增強(qiáng)，線狀分子、分子量較大的多糖親和力較強(qiáng)，支鏈多糖較直鏈多糖更易吸收。常用的離子交換劑有樹脂類、纖維素類和葡聚糖類。陰離子交換柱層析法適用于各種酸性、中性多糖和糖胺聚糖的分離純化。在pH6.0時(shí)，酸性多糖能吸附于交換介質(zhì)上，中性多糖不能吸附，然后用pH相同但離子強(qiáng)度不同的緩沖溶液將酸性強(qiáng)弱不同的酸性多糖分別洗脫下來(lái)，但如果柱子為堿性，則中性多糖也能吸附。但中性多糖不能與硼砂形成絡(luò)合物，所以可將柱子處理成硼砂型的，用不同濃度的硼砂溶液洗脫，也能將不同的中性多糖分離開(kāi)來(lái)。檢測(cè)手段一般沿用苯酚-硫酸法，也常用LKB柱層析系統(tǒng)，用比旋光度、示差折光及紫外檢測(cè)器，各組分的峰位自動(dòng)記錄，分離效果好且方便。

（4）凝膠柱層析

常用的凝膠有葡聚糖凝膠（Sephadex）、瓊脂糖凝膠（Sepharose）以及Sephacryl。以不同濃度的鹽溶液和緩沖液作為洗脫劑，其離子濃度不低于0.02mol/L，通過(guò)凝膠柱層析多糖可分為不同分子大小的糖。本法除進(jìn)行多糖分級(jí)外，還可以用于小分子雜質(zhì)的去除，或者在乙醇沉淀法進(jìn)行分級(jí)后，再根據(jù)分子大小進(jìn)一步分級(jí)。

（5）鹽析法

根據(jù)不同多糖在不同鹽濃度中具有不同溶解度的性質(zhì)，加入不同鹽析劑使不同多糖逐步析出，常用的鹽析劑有NaCI、KCl和（NH4）2SO4等，其中以（NH4）2SO4效果最佳。

（6）其他方法：利用不同多糖分子大小、形狀及電荷不同而在電場(chǎng)作用下達(dá)到分離目的的制備性電泳，分離效果較好。用己知超濾膜分離不同形狀與分子量大小的多糖的超濾法，以多糖與抗血清產(chǎn)生選擇性沉淀為原理的親和層析法，以及具有快速高效特點(diǎn)的制備性高效液相層析法，已有效的應(yīng)用于小規(guī)模純品制中。此外，多糖的分級(jí)純化方法還有凍融分級(jí)和超速離心等方法。