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【摘要】目的研究紫草多糖的體外抗氧化作用。方法通過·OH、DPPH·、超氧陰離子、脂質(zhì)過氧化及紅細胞溶血反應體系，檢測紫草多糖的抗氧化能力。均采用比色法測定。結果紫草多糖對·OH、DPPH·、超氧陰離子、脂質(zhì)過氧化及紅細胞溶血均有清除或抑制作用。結論紫草多糖在體外具有抗氧化作用。

【關鍵詞】紫草；多糖；抗氧化

新疆紫草Arnebiaeuchroma(Royle)Johns為紫草科軟紫草屬植物，又名新疆軟紫草，收載于《中國藥典》，是我國常用的中藥［1］，多為草本，以根入藥，因其根皮暗紫色，故名“紫草”。該藥具有涼血活血、解毒透疹之功效。已有研究表明紫草具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎及鎮(zhèn)痛、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等生理活性［2］。現(xiàn)代醫(yī)學證明，心腦血管疾病、衰老及腫瘤疾病的發(fā)生和發(fā)展與體內(nèi)的活性氧自由基有密切關系，而許多抗氧化成分可以清除這些自由基，阻斷由它們引發(fā)的體內(nèi)脂質(zhì)過氧化，能夠預防上述疾病的發(fā)生發(fā)展近年來，人們發(fā)現(xiàn)天然藥物是極有潛力的抗氧化劑資源，從中尋找新的抗氧化劑是現(xiàn)代醫(yī)藥和保健品行業(yè)的發(fā)展方向。多糖是繼黃酮類、多酚類、皂苷類及鞣質(zhì)類之后從天然植物中發(fā)現(xiàn)的又一類抗氧化活性成分［3］。許多植物多糖對各種活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)具有清除作用，能減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的生成量，提高抗氧化酶活性(超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽過氧化物酶GSHPx等)，表現(xiàn)出多種途經(jīng)的抗氧化作用［4，5］。研究多糖及其衍生物的抗氧化活性，對于開發(fā)出更多更好的天然抗氧化劑，逐步取代存在一定毒性、致畸性和潛在致癌性的化學合成抗氧化劑，具有重要的現(xiàn)實意義［6］。本實驗研究紫草多糖的體外抗氧化活性。

1材料與儀器

1.1藥材與試劑紫草，購自新疆阿克蘇地區(qū)，干燥粉碎過篩備用；1，1二苯基2苦肼基自由基（Sigma公司）；Tris(北京拜爾迪生物公司)；2硫代巴比妥酸（上海科豐化學試劑有限公司）；焦性沒食子酸（天津市富宇精細化工有限公司）；其余試劑均為分析純。

1.2儀器多功能酶標儀（Thermo3001VARIOSKANFLASH）；AR2140型萬分之一電子天平（梅特勒托利多儀器有限公司制造）；DL360超聲波清洗機(浙江象山縣石浦海天電子儀器廠)。

2方法

2.1紫草多糖的制備稱取100g紫草粗粉用600ml的石油醚（30～60℃）脫脂3次，晾干，然后加入1000ml蒸餾水提取數(shù)小時，趁熱過濾，重復3次。合并水提液并濃縮至原體積的1/4，加入3倍量無水乙醇，靜置過夜后抽濾。將沉淀用無水乙醇、丙酮和乙醚依次洗滌，真空干燥，即得粗紫草多糖。

2.2多糖對·OH的清除作用［7］

空白組：30μl0.75mmol/L鄰二氮菲溶液中加入60μl0.15mol/L的PBS（pH=7.4），加入30μl的蒸餾水，充分混勻后，加入30μl0.75mmol/L的硫酸亞鐵，混勻后，再加入30μl的1%的H2O2混勻。37℃的水浴中60min后，在536nm處，測定吸光度為A1；空白對照組：以30μl的蒸餾水代替H2O2重復上述操作，在536nm處，測定吸光度為A2；樣品組：以30μl的樣品代替30μl的蒸餾水重復空白組操作，在536nm處，測定吸光度為A3；樣品對照組：60μl0.15mol/L的PBS中加30μl的樣品，充分混勻后，加入90μl的蒸餾水，在536nm處測定吸光度為A4；空白參比組：60μl0.15mol/L的PBS加入120μl的蒸餾水，在536nm處測定吸光度為A5。清除率（%）=［（A3A4A1+A5）/（A2A1）］×100%

2.3多糖對DPPH·的清除作用［8］

向100μlDPPH·乙醇溶液（濃度為0.2mmol/L）中加入100μl紫草多糖溶液。渦旋振蕩器混勻，室溫，避光放置30min后，在517nm處測定吸光度，平行測定3次，并以相同濃度的維生素C作為陽性對照，計算清除率。

清除率（%）=［A0（A1A2）］/A0×100%式中：A0為DPPH·溶液100μl+無水乙醇100μl的吸光度；A1為DPPH·溶液100μl+樣品溶液100μl的吸光度；A2為樣品溶液100μl+無水乙醇100μl的吸光度。

2.4多糖對超氧陰離子的清除作用［9］

取濃度為0.05mol/L的TrisHCl（pH=8.2）緩沖液100μl，25℃預熱20min，加入50μl不同濃度的紫草多糖溶液，立即加入40μl的3mmol/L的鄰苯三酚，振蕩使之充分反應，4min后，用10μl的3mol/L的HCl終止反應，在325nm處測定吸光度（A1），平行測定3次，并以相同濃度的維生素C作為陽性對照。模型對照組（A0）用50μl的蒸餾水代替樣品液。空白對照組（A2）用40μl的蒸餾水代替鄰苯三酚。

抑制率（%）=［（A0A1+A2）/A0］×100%

2.5多糖對卵黃脂質(zhì)過氧化的抑制作用［10］

卵黃懸液的配制：新鮮雞蛋去卵清，卵黃用等體積的pH=7.4的0.1mol/LPBS配成1∶1懸液，并用磁力攪拌器攪拌10min（置于冰箱中4℃）備用，使用前用PBS稀釋成1∶25的懸液。吸取1∶25的卵黃懸液20ml，加入20ml的不用濃度的紫草多糖溶液，再加入20ml的25mmol/L的FeSO4，用pH=7.4，0.1mmol/L的PBS補至200ml，37℃振蕩15min，取出后再加入50μl的20%的三氯乙酸，4000r/min離心8min，吸取100ml上清液加入50ml0.8%TBA，封口，沸水浴中煮15min，在532nm處測吸光度，平行測定3次，并以相同濃度的維生素C作為陽性對照。以不加樣品管的吸光度為A0，以樣品加PBS管的吸光度為A樣。

抑制率（%）=［（A0A+A樣）/A0］×100%

2.6多糖對紅細胞溶血的抑制作用［11］

小鼠摘眼球取血，加入肝素制成抗凝血，以4000r/min離心5min，再用預冷的生理鹽水洗3次，制成0.5%的紅細胞懸浮液。取紅細胞懸浮液200ml，加入樣品溶液40ml，最后加入0.1mol/L的H2O220ml，混勻，于37℃水浴中溫浴60min，然后3000r/min離心10min，取上清液，用生理鹽水稀釋5倍，于415nm處測定吸光度（以紅細胞在超純水中的溶血率為100%計算）。

抑制率（%）=（A0A樣）/（A0-A）×100%式中：A0，H2O2誘導對照組吸光度；A樣，樣品組吸光度；A，正常組吸光度。

2.7統(tǒng)計分析

每次試驗均設4個平行管，取平均值為1次試驗數(shù)據(jù)，試驗重復3次，采用SPSS10.0軟件處理，所有數(shù)據(jù)均用±s表示。

3結果

3.1紫草多糖清除羥自由基的能力結果見圖1。

Fenton反應是最常見的產(chǎn)生羥自由基的化學反應，H2O2的量和Fenton反應產(chǎn)生的·OH的量成正比，當給予電子受體后，用gress試劑顯色，形成紅色物質(zhì)，其呈色與·OH的量成正比關系。由圖1可見，紫草多糖在實驗濃度范圍內(nèi)對羥自由基的清除作用呈現(xiàn)出良好的量效關系，并且濃度越大，紫草多糖的清除羥自由基的能力越接近維生素C。

3.2紫草多糖清除DPPH·的能力結果見圖2。

人工合成的DPPH是少數(shù)化學性質(zhì)穩(wěn)定的自由基之一，其乙醇溶液呈深紫色，在517nm附近有強吸收峰。當DPPH·溶液中加入自由基清除劑時，由于與其單電子配對而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其接受的電子數(shù)成定量關系，因而可用比色法進行定量分析，評價樣品的抗氧化能力［12］。從圖2可以看出，紫草多糖具有較強的清除DPPH自由基的能力，且隨著樣品溶液濃度的增加，清除率逐漸增高，呈劑量依賴關系。

3.3紫草多糖清除超氧陰離子的能力結果見圖3。

在堿性條件下，鄰苯三酚發(fā)生自氧化反應，生成O2·和有色中間產(chǎn)物，該有色物質(zhì)在325nm處有一特征吸收峰。當加入清除劑時，O2·的生成受到抑制，鄰苯三酚的自氧化反應受阻，溶液在325nm處的吸光度減小。故通過測定A325值可以定量計算出清除劑的清除率［13］。實驗結果（圖3）表明，紫草多糖、維生素C對超氧陰離子的生成均有清除作用，且隨著濃度的增加作用增強。在較低濃度時，紫草多糖對超氧陰離子的清除作用強于維生素C。

3.4紫草多糖對卵黃脂質(zhì)過氧化的抑制作用結果見圖4。

卵黃中磷脂C2位上所含極低密度脂蛋白（VLDL）和低密度脂蛋白（LDL）中的不飽和脂肪酸（PUFA）在亞鐵離子的催化下，能誘發(fā)過氧化，產(chǎn)生烷氧基（RO·）和烷過氧基（ROO·），從而引發(fā)鏈式反應。且在加熱的條件下，其產(chǎn)生的過氧化物可與硫代巴比妥酸（TBA）反應產(chǎn)生紅色化合物，并在532nm處有最大吸收［14］。由圖4可知，紫草多糖、維生素C對卵黃脂質(zhì)過氧化的抑制作用呈劑量依賴性，且在相同濃度下，紫草多糖對脂質(zhì)過氧化的抑制作用接近維生素C。

3.5紫草多糖對紅細胞溶血的抑制作用結果見圖5。

過氧化氫在體外誘導紅細胞氧化而發(fā)生溶血，致使紅細胞膜流動性降低，膜脆性增加，改變細胞膜的完整性，導致紅細胞損傷，胞內(nèi)物質(zhì)外流。結果表明，紫草多糖、維生素C均能降低H2O2誘導的紅細胞氧化溶血率，溶血抑制率隨著樣品濃度的增大而增加，當濃度低于12.5mg/L時，紫草多糖與維生素C抑制溶血的能力相當。

4討論

O2·、·OH及H2O2是生物體內(nèi)主要的活性氧自由基，由它們引發(fā)的體內(nèi)脂質(zhì)過氧化是機體衰老、動脈硬化、心血管病及腫瘤發(fā)生的重要原因，而使用生物抗氧化劑切斷過氧化鏈式反應,可以抑制機體的自由基損傷，從而保持最佳健康狀態(tài)和防治相關疾病，延緩衰老［15］。目前國內(nèi)外也已將抗氧化檢測用于抗衰老等保健食品的評價，對保健食品的開發(fā)也具有積極作用［16］。

我們的研究表明，紫草多糖具有較強的清除羥自由基、DPPH·及超氧陰離子和抑制卵黃脂質(zhì)過氧化的作用，且呈劑量依賴性，其可能的作用機理如下：①紫草多糖可以捕捉脂質(zhì)過氧化鏈式反應中產(chǎn)生的活性氧，減少脂質(zhì)過氧化反應鏈的長度，阻斷或減緩脂質(zhì)過氧化的進行；②對于·OH而言，可快速地攫取多糖碳氫鏈上的氫原子結合成水，而紫草多糖的碳原子上則留下一個成單電子，成為碳自由基，進一步氧化形成過氧自由基，最后分解成對機體無害的產(chǎn)物；③對于O2·，紫草多糖可與其發(fā)生氧化反應，最終達到清除的目的［17］。

目前，對紫草多糖抗氧化的研究不夠深入，抗氧化作用與多糖結構的關系仍不明確。此外，紫草多糖用于藥理學實驗的是一些粗制品，這使得要在分子水平上闡明其藥理作用和作用機制受到了很大限制，有待于我們的進一步深入開展多糖的純化以及抗氧化作用與其構效關系的研究。新晨：

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