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1儀器與試藥
1.1菌種
金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)10123]，均購自中國藥品生物制品檢定所;黑曲霉(ATCC16404)購自廣東省微生物研究所。
1.2培養基
營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、營養肉湯培養基、改良馬丁培養基、改良馬丁瓊脂培養基、膽鹽乳糖培養基。
1.3供試品
康腹止瀉片(批號41EA1)，大幸藥品株式會社。
2方法與結果
2.1菌液的制備[4]
2.1.1大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌
取新鮮培養物接種至營養肉湯培養基中，培養18～24h;培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1mL含菌數為50～100cfu的菌懸液。用于控制菌驗證時制成每1mL含菌數為<100cfu的菌懸液。
2.1.2白色念珠菌取新鮮培養物接種至改良馬丁培養基中，培養24～48h;培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1mL含菌數為50～l00cfu的菌懸液。
2.1.3黑曲霉取新鮮培養物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養基中，培養5～7d，加入0.9%無菌氯化鈉溶液3～5mL，將孢子洗脫。然后，用適宜的方法吸出胞子懸液至無菌試管內，用0.05%(體積分數)聚山梨醇的0.9%(體積分數)無菌氯化鈉溶液制成每lmL含孢子數50～100cfu的孢子懸液。
2.2供試液的制備
取樣品10g，加入pH7.0氯化鈉?駁鞍纂嘶撼逡褐?100mL，用勻漿儀打碎，搖勻，制成1∶10的供試液。
2.3驗證試驗
驗證實驗所用培養基均按《中國藥典》2010年版附錄“微生物限度檢查法”要求，進行培養基適用性檢查，且均符合規定。
2.3.1細菌、真菌及酵母菌計數(平皿法?才嘌?基稀釋法)在確定適合的檢查方法后，驗證試驗至少應進行3次獨立的平行試驗，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。
試驗組:各取1∶10供試液1、0.5、0.2mL和試驗菌液1mL，分別注入平皿中，立即傾注相應瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數。
菌液組:取試驗菌液1mL注入平皿中，立即傾注相應瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，測定所加的試驗菌數。
供試品對照組:各取1∶10供試液1、0.5、0.2mL，按試驗組操作，不加菌液，測定樣品本底菌。
計算各試驗菌株的回收率，結果見表1。表1計數驗證菌各菌株回收率結果
由表1可見:黑曲霉的回收試驗，當供試液為1mL?皿-1時，3次試驗的回收率均即可達到70%以上;白色念珠菌當稀釋至0.5mL?皿-1時，3次試驗的回收率達到70%以上;而大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌3個菌株的回收率試驗，要稀釋至0.2mL?皿-1，3次驗證的回收率才能均達到70%以上。因此本品的細菌計數、真菌及酵母菌計數均可用培養基稀釋法檢查:細菌計數用0.2mL?皿-1，真菌及酵母菌計數用0.5mL?皿-1。
2.3.2控制菌檢查法的驗證本品為含有藥材粉末投料的口服制劑,控制菌應檢查大腸埃希菌和大腸菌群，驗證大腸菌群檢查法時，采用大腸埃希菌作為試驗菌。新晨
2.3.2.1大腸埃希菌檢查法的驗證取1∶10供試液10mL及大腸埃希菌菌液1mL加入100、200mL的BL增菌培養基中，按大腸埃希菌的檢查法進行檢驗。
2.3.2.2大腸菌群檢查法的驗證取1∶10供試液1mL及大腸埃希菌菌液1mL加入不少于15、30mL的膽鹽乳糖發酵培養基中，按大腸菌群的檢查法進行檢驗。
由表2可知，試驗組均檢出大腸埃希菌，因此本制劑的大腸埃希菌和大腸菌群均可用常規法檢查。
3討論
本品含有木餾油、阿仙粉、黃柏粉等成分，有一定的抑菌作用，驗證試驗結果證明，本品對革蘭陽性菌有較強的抑制作用。藥典收載的除去供試品抑菌作用的方法有培養基稀釋法、薄膜過濾法、離心沉淀法等，或幾法聯用。由于本品是中成藥，推斷其抑菌作用不會太強，因此嘗試采用培養基稀釋法，通過擴大培養基的使用量，使供試品在培養基中稀釋，結果各規定菌株的回收率均達到藥典要求;控制菌則用常規法即能順利檢出試驗菌。培養基稀釋法操作簡單，不需要特殊儀器設備，只需增加培養基量，即可很好地消除本制劑在試驗條件下的抑菌作用問題，因此本方法簡便快捷、準確有效，能很好地控制康腹止瀉片的質量。表2控制菌驗證結果
【參考文獻】
[1]金晴昊，崔京浩，郭健鵬.老鸛草的研究[J].時珍國醫國藥，2005，16(9)：840-841.
[2]金建玲，欒永娜，華國強.含小檗堿中藥的抑菌活性與小檗堿含量的關系[J].中醫藥學報，2005，33(5):19-21.
[3]許華玉，杜鵑，湯楊.藥品中微生物污染檢測方法驗證的必要性[J].中國藥品標準，2005,6(4):262,46-47.
[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部[M].北京:中國醫藥科技出版社,2010:附錄79.
[5]林麗英,湛文青,饒春意.野牡丹止痢片微生物限度檢查法的建立[J].中藥材,2006,29(3):299-302.