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一RU486調控系統的結構

1RU486調控系統的基本結構

RU486調控系統是1994年被Wang等[1]提出的,它由嵌合調控子反式作用調控區和目的基因區兩部分組成。反式作用調控區含有任意啟動子控制下的嵌合調控子(chimericregulator,GLVP),后者是一種嵌合型的可誘導轉錄因子,它包括酵母轉錄因子Gal4的DNA結合區(Gal4DBD)、單純皰疹病毒蛋白VP16激活區(VP16AD)和PR-891突變體改良后的C末端配體結合區(PRLBD-891)三部分。目的基因區是指在最小啟動子(TATA盒或胸腺嘧啶脫氧核苷激酶啟動子tk)和四個Gal4DNA結合區串聯體(p17×4)調控下的目的基因,如圖1。

圖1RU486調控系統的結構示意圖

在GLVP中,Gal4DBD代替了孕酮受體的DNA結合區,從而避免了任何激活內源性孕酮敏感性基因的可能,并且由于GAL4DBD在哺乳動物細胞中不

存在,目前也沒有發現任何哺乳動物的靶基因可以被Gal4激活,所以這一調控子只會調控目的基因的表達,而不會影響任何內源基因[1]。PR-891是指野生型孕酮受體在891位點平頭切斷造成的突變體,因此其不能與孕酮受體激活劑R5020結合,但卻可以與抗孕酮片RU486結合,從而在RU486存在時激活孕酮受體介導的基因。這可能是由于PR-891比野生型受體少42個氨基酸,而孕酮結合位點屬于缺失的下游內,RU486結合區則位于上游位置[2]。這就避免了給予RU486時,激活內源性孕酮受體誘導其它基因引起一系列的細胞反應。并且由于反式作用調控子是一種嵌合型的可誘導轉錄因子,所以它不再與孕酮反應元件(PREs)或糖皮質類固醇應答成分(GREs)結合[3],干預孕酮受體介導的轉錄,取而代之的是在RU486作用下,這一調控子僅僅與目的基因區的Gal4DBD結合,并激活目的基因轉錄表達[2]。由于PRLBD-891的轉活能力較差,而VP16AD,即VP16的C末端為酸性,可以直接與轉錄起始復合物中的轉錄因子TFIIB、TATA結合蛋白(TBP)和TBP輔助因子TAFII40相互作用,具有很強的轉活功能。

在目的基因區內,啟動子有兩種:胸腺嘧啶脫氧核苷激酶啟動子(tk)和腺病毒E1b基因中僅僅包含TATA盒的最小啟動子。Tsai[2]等使用氯霉素乙酰轉移酶(CAT)作報告基因對二者進行比較發現,p17x4-TATA-CAT比p17x4-tk-CAT轉染時CAT基礎活力明顯要低一些;而給予RU486后,前者的CAT效能可達大約50倍,后者僅有10~15倍。這可能是由于tk啟動子中含有GC和CAAT盒等序列,從而使轉錄效能較大。所以TATA盒啟動子結構應用于要求目的基因的基礎表達很低時,而在基礎活力稍高能夠耐受,要求轉錄效能很大時應使用tk啟動子結構。對于p17x4,Gal4DNA結合區的四個串聯體則在這一系統中可以提供最大的轉錄效能。

2RU486調控系統的結構改進

為了使RU486調控系統將來能夠應用于人類的基因治療,降低細胞毒性和免疫原性,Mark等[4]1999年使用NFκB家族成員――人的p65激活區(286~550)替代VP16激活區,構建出新的RU486反式作用調控區(GLP65),以減少VP16激活區可能帶來的免疫反應。他們發現使用TATA盒啟動子啟動目的基因時,在沒有RU486的情況下,GLP65的基礎活力明顯低于GLVP;給予RU486后兩個調控子均表現出配體劑量依賴性的目的基因表達,這時GLVP組目的基因的表達更多,不過由于GLP65的基礎值很低,所以RU486給予時,目的基因的表達倍數會更高。tk做目的基因啟動子時,上述兩種RU486系統則不管是否給予配體,兩者的作用相當。所以在使用GLP65時,最好選用TATA盒啟動子作為目的基因的啟動子。

另外,Mark等[4]在反式調控區與目的基因區之間插入小雞β-球蛋白5’端區域作為絕緣子(INS)將二者分隔,使目的基因在沒有RU486的情況下不受調控系統的調節而產生表達。但是他們發現在活體大鼠模型,沒有RU486表達,有無絕緣子都不會有目的基因的表達;但是HELA細胞水平上,不含絕緣子者的目的基因則會有較少的表達,而含絕緣子者沒有。

二RU486調控系統的激活

RU486調控系統的激活過程與甾體類激素被其配體激活相似。反式作用調控子可以在不同的組織定向啟動子作用下,在各自靶向的組織或細胞進行表達。當存在RU486時,RU486與PRLBD-891相結合,促使反式作用調控子發生構象變化形成二聚體而激活,激活的反式作用調控子與目的基因上游的Gal4DNA結合區四聚體結合,從而啟動目的基因的表達,如圖2。反之,在沒有RU486的情況下,由于反式作用調控子的構象不會發生變化,所以RU486調控系統不能被激活,即目的基因不能轉錄表達。這樣,RU486調控系統便可根據RU486的量及給予時間,對目的基因的表達水平及其表達時程的長短進行控制[2]。

圖2RU486調控系統激活示意圖

三RU486調控系統的特點

1.調控子的激活依賴于RU486的給予。在沒有RU486的情況下,調控子所表達的蛋白沒有毒性,也不傳遞表型,調控子不能激活目的基因的表達。只有給予RU486激活調控子后,目的基因才會表達蛋白。

2.RU486調控系統在轉錄水平調控目的基因的表達,所以可以直接控制后者的表達。

3.RU486給予量很小,僅僅能夠激活調控子,并不能抑制內源性孕酮受體或糖皮質激素受體的功能。眾所周知,RU486作為孕酮和糖皮質激素的拮抗劑時,它的濃度范圍須達微克分子級,所以在臨床使用中RU486作為流產藥物的劑量應達600mg或10mg/kg。然而,在RU486調控系統中的RU486只需很少的濃度就可使目的基因表達。Wang等曾做RU486的濃度對照實驗發現,當RU486濃度僅有0.1nmol/l時即可誘導目的基因的表達,并且系統達到最大活力時的濃度也僅須1nmol/l,這一劑量要比產生內源拮抗作用的濃度低1000倍[1]。

4.調控過程是可逆的,且其使目的基因大量表達。RU486停藥后目的基因表達停止,RU486的重復給予也會重復誘導目的基因的表達。

5.RU486調控系統非常適用于中樞神經系統的基因治療。因為服用RU486后,其很容易通過血腦屏障,在臨床中可以安全使用。

四RU486調控系統的應用

1RU486調控系統在單純皰疹病毒載體(HSV)中的調控

Oligino[5]等將RU486系統引入無復制能力HSV載體中,lacZ為目的基因的目的基因區(p17x5-TATA-lacZ)插入HSV的胸腺嘧啶脫氧核苷激酶位點,反式作用調控區(VP-GL)置入同一載體的糖蛋白C位點,構建成HSV重組病毒GVHLZ。在病毒轉染Vero細胞24h后,他們發現如果不給RU486,lacZ表達很低;若將細胞培養在含10-7mol/L的RU486基質中時,lacZ就會大量表達。并且,10-7mol/L的RU486即可使目的基因表達達最大。將GVHLZ注入SD大鼠海馬后12和36h,給予RU486或生理鹽水作對照,48h后處死大鼠取出海馬進行檢測,Oligino發現lacZ表達比對照組高達150倍。

2RU486調控系統在腺病毒載體(Ad)中的調控

Magnus等[6]首次將RU486系統引入重組腺病毒載體中,CAT作為報告基因與p17x5-TATA結合插入Ad中形成AdG5TripCAT,反式作用調控區插入Ad形成Ad5dl309,將兩者共轉染HeLa細胞。他們在轉染開始給予RU486后16h用ELISA法檢測CAT的表達,發現CAT的表達隨RU486給予量增加而逐漸增大,當RU486達4umol/l時CAT達最大。

2004年,錢程[7]等成功構建出RU486調控并攜帶IL12的第三代腺病毒,并將其進行了體外及體內的實驗驗證,發現RU486可以誘導和調控IL12的表達,這種誘導呈劑量依賴性變化,并且在調整RU486的給藥間隔和重復給藥,IL12的表達也會隨其波動變化或維持在一定水平,RU486調控系統的基因開關作用表現完全。最近,Schillinger[8]等也將RU486誘導調控系統引入到高血壓的基因治療,將RU486調控系統控制的心房利尿肽(ANP)插入到第三代腺病毒載體中,從而實現了對ANP表達的劑量和時程控制。并且第三代腺病毒的超大容量、低免疫源性和低細胞毒性等優點使得這一系統更加完美。

3RU486調控系統在果蠅中的調控

GreggRoman[9]等利用RU486調控系統對轉入果蠅的目的基因進行時間和空間的調控。他們將RU486調控系統插入到P{Switch}放大檢測元件構成的質粒注入果蠅胚胎中,待果蠅4天大時給予RU486飲食。結果發現通過RU486基因開關可以對目的基因進行時序上的調控,在給予RU486飲食后1h即可得到非常高濃度的表達,3h后指示針可以檢測到目的基因的活力。并且RU486的給予不會引起任何的不良反應,它不會增加果蠅的致死率,也不會影響果蠅的趨光性、趨地性和逃避反應等行為,僅有基因開關的誘導功能。Osterwalder[10]等則利用RU486調控系統對組織特異性的基因表達進行調控,發現在果蠅胚后期,RU486調控系統可以調控幼蟲神經肌肉接頭突觸前后的轉基因表達。

4RU486調控系統在轉基因動物中的調控

2005年Bo等[11]又將RU486誘導調控系統轉入到轉基因大鼠體內,通過控制RU486的給予觀察轉基因大鼠心內轉基因的表達。他們使用心臟特異性α肌球蛋白重鏈(αMHC)啟動子調控GLP65系統,將含有反式作用調控區的載體注射入FVB/N受精卵的前核得到αMHC-GLP65轉基因大鼠,然后同樣方法得到含人生長激素目的基因區(17X4-tk-hGH)的轉基因大鼠,兩者雜交得到雙重轉基因大鼠(αMHC-GLP65/Hgh),然后每天給大鼠腹腔內注射RU486(500ug/kg)觀察。結果發現不給予RU486,hGH的表達始終處于很低的基礎值;而隨著RU486的不斷給予轉基因大鼠的hGH呈劑量依賴性表達,但在停藥后七天內轉基因表達即可降至基礎水平;對于單轉基因αMHC-GLP65大鼠,給予RU486后未發現任何表型出現。并且他們還首次報道,這一調控系統的作用對于任何年齡的大鼠都可適用。

五其他的基因開關

目前基因開關的種類已經有很多,如四環素調控系統、甾體激素、免疫抑制劑、β-D-異丙基硫代半乳糖苷、FK1012細胞膜調控系統等等。雖然這些調控系統各自有各自的應用范圍和優點,但是其中有些可能會激活其它的內源基因,如FK1012細胞膜調控系統,它是運用一種免疫抑制劑FK506的二聚體FK1012,通過激活細胞酪氨酸激酶途徑來調控基因表達,因此由于細胞膜受體激酶級聯反應干預多種內源基因的表達,所以這一系統無法調控特異的目的基因[2]。有些效力較低,或者在動物和人轉基因運用中毒性較大(β-D-異丙基硫代半乳糖苷)。四環素調控系統則由于四環素在骨與其他組織的清除率較慢而引起關注。