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1TGF-β1-Smads信號通路概況

1.1TGF-β亞型:TGF-β1最早是由Delaro和Todaro于1978年在研究病毒轉化細胞過程中發現的,哺乳動物體內主要有3種亞型,即TGF-β1、2和3。TGF-β不同亞型在創傷愈合中的作用不同。如TGF-β1、2有助于瘢痕組織形成,TGF-β3具有抗瘢痕作用。

2.2TGF-β的激活:TGF-β分泌后必須經過激活才能發揮效應,即TGF前體分子LTGF必須激活為成熟的TGF-β形式才能與受體結合,然后激活信號轉導通路。與大多數其他激素不同,成熟的TGF-β在分泌后仍然保持與它的前肽共價結合,成熟的TGF-β的這種復合物形式不能被信號受體識別,因此被稱為TGF-β前肽。潛在相關肽(LAP)與潛在TGF-β連接蛋白(LTBP)經二硫鍵共價結合,LTBP有利于TGF-β/LAP復合物的分泌、儲存和激活。TGF-β的激活需要從蛋白氨基端去掉與LTBP連接的羧基端前區,當LTGF被蛋白裂解移至細胞外,TGF-β被激活。這是一個復雜的過程,涉及LTGF構象改變。若機體受到炎癥或損傷因素如內毒素[2]、纖溶酶、基質金屬蛋白酶(MMP)、活性氧等刺激后TGF-β可被激活[3]。

另一個TGF-β激活劑是血小板反應蛋白(TSP-1),它具有調節細胞間的黏附、促進血管發生和基質再建的作用。TSP-1在體外可以通過改變LAP構象激活潛在的TGF-β,激活TGF-β的整合蛋白αVβ6,后者正常時僅在上皮細胞少量表達,在感染或損傷時誘導表達。通過基因敲除動物的研究證實,整合蛋白αVβ6誘導TGF-β的激活。整合蛋白αVβ6-/-動物可以抵抗大劑量博萊霉素誘導的肺損傷和纖維化[4]。

1.3TGF-β受體:TGF-β受體(TGFR)有5種不同類型(Ⅰ-Ⅴ型),其中I型、Ⅱ型是跨膜絲/蘇氨酸激酶受體,其胞質區段有絲-蘇氨酸激酶活性,與受體后細胞內通訊有關。如I型受體胞內區外側一段富含絲/蘇氨酸殘基稱GS區,是受Ⅱ型受體磷酸化激活的部位。而I型、Ⅱ型受體細胞外區則富含半胱氨酸殘基。Ⅲ型受體,亦稱為β聚糖,是一個錨著蛋白多糖,無信號轉導結構但可提高TGF-β對Ⅱ型受體的親和力[5]。

1.4TGF-β受體激活:TGF-β首先與相應的Ⅱ型受體識別結合而被磷酸化激活成為具有激酶的活性,再由活化的Ⅱ型受體募集I型受體,并將I型受體的GS區磷酸化而將其激活,活化的I型受體與下游底物相互作用,再將信號傳遞下去[6]。給予TGFβⅡ型受體的嵌合體能減輕整合蛋白αVβ6對的TGF-β的激活,對博來霉素所致的肺損傷具有保護作用[7]

1.5Smads蛋白家族:Smads家族蛋白在將TGF-β信號從細胞表面受體傳導至細胞核的過程中起到關鍵性作用,且不同的Smad介導不同的TGF-β家族成員的信號轉導。TGF-β作為配體形成的受體復合物,激活Smads進入核內,共同激活或抑制它們調節的靶基因的轉錄。根據結構,Smad蛋白分成R-Smad,Co-Smad和I-Smad3個亞家族,至少包括9種Smad蛋白,用Smadl-9表示,按功能分為3類:即受體活化型或通路限制性Smad(R-Smads)、共同通路型Smad(Co-Smad)和抑制性Smad(I-Smads)。R-Smads能被I型受體激活并與受體形成短暫復合物,它又分為兩類,即由激活素TGF-β激活的AR-Smads,包括smad2、Smad3:和由BMP等激活的BR-Smads,包括Smadl、Smad5、Smad8和Smad9。Co-Smad包括Smad4,是TGF-β家族各類信號傳導過程中共同需要的介質。I-Smads包括Smad6和Smad7,可與激活的I型受體結合,抑制或調節TGF-β家族的信號轉導[8,9]。

2急性肺損傷時TGF-β的變化

ARDS的纖維化(pulmonaryfibrosis,PF)是肺部炎癥導致肺泡持續性損傷及細胞外基質(extracellularmatrix,ECM)細胞反復破壞、修復、重建及過度沉積的過程,是機體組織遭受損傷后的過度修復反應[10]。ARDS病理過程分為滲出期、增生期和纖維化期[11]。以往研究認為肺急性炎癥和纖維化可能是兩個相對獨立的過程,但近年資料表明,在ALI、ARDS的早期TGF-β1即被激活[12,13],且肺纖維化程度與ARDS的死亡率密切相關[14]。

研究表明:ARDS患者早期肺泡灌洗液中即可發現高表達的TGF-β1,并且其高表達與隨后的肺水腫形成、促炎性細胞因子的釋放[7,15]以及患者氧合指數降低均密切相關[15,16]。Beer等[17]證實TGF-β能抑制肺表面活性物質的生成,并能增加Fas誘導的肺上皮細胞的凋亡[18]。多位學者發現不同因素誘導的急性肺損傷模型中肺組織TGF-β1的含量均明顯增高。例如,在機械通氣誘導的大鼠急性肺損傷模型,Imanaka等[19]發現肺組織TGF-β1含量明顯增高的同時伴隨肺組織中性粒細胞浸潤和巨噬細胞活化;在失血性休克肺損傷大鼠模型中,Shenkar等[20]發現失血后1h肺泡巨噬細胞的TGF-βmRNA表達即明顯增加,并可見大量中性粒細胞浸潤和間質充血水腫。若給予TGF-β單克隆抗體肺組織的損傷程度可明顯減輕。Wesselkamper等[21]進一步證實,在鎳所致ALI中,給予TGFβⅡ型受體的嵌合體,能有效減輕鎳所致的肺血管通透性的增高和肺水腫發生。

TGF-β具有多種生物學效應,不僅對多種炎性細胞如巨噬細胞和中性粒細胞或成纖維細胞有很強的趨化作用[22,23],還能刺激TNF-α,IL-1β,IL-6等炎性細胞因子釋放[24,25]。TGF-β可通過以下三種途徑影響IL-6的表達:(1)誘導細胞內H2O2一過性增加。H2O2可劑量依賴性誘導IL-6的基因表達。而抗氧化劑則可抑制TGF-β誘導的IL-6的基因表達;(2)刺激鈣離子的內流,鈣離子可增加IL-6的表達,同時調節激活蛋白一1的活性;(3)絲裂原激活的蛋白激酶參與了TGF-β所誘導的IL-6表達[25]。

3TGF-β對細胞外基質(ECM)合成的調控作用

急性肺損傷纖維化的發生是膠原蛋白等細胞外基質(ECM)合成與降解不平衡的結果,在ECM降解過程中,金屬蛋白酶起著非常重要的作用。TGF-β是最強的細胞外基質沉積促進劑,使ECM合成增加,而降解減少[26]。TGF-β促進ECM的合成體現在多個環節:其一是上調基質成分基因的轉錄和翻譯等步驟。例如促使膠原、纖維粘連蛋白和基質金屬蛋白酶-1抑制劑的mRNA表達水平增加[27],促進胞外基質受體的轉錄、翻譯和蛋白形成,從而促進ECM的沉積;其二是通過選擇性抑制膠原酶的合成、誘導膠原酶抑制物的產生或抑制蛋白酶抑制劑表達與激活,最終使膠原降解減少、細胞外基質在肺內積聚,使肺泡壁增厚,促進纖維化形成。TGF-β對上述兩類酶合成的影響一定程度上可根據編碼這些蛋白的mRNA表達水平得到反映。例如TGF-β可刺激肺成纖維細胞產生膠原纖維,誘導I、Ⅳ膠原mRNA表達;利用支氣管滴注TGF-β的方法建立小鼠支氣管周圍纖維化模型,在使用TGF-β7天,可檢測到小鼠氣道上皮I、Ⅲ型膠原mRNA表達明顯增加[28]。TGF-βmRNA及蛋白水平的增加均可上調大多數基質蛋白mRNA水平,導致蛋白合成的增加。

激活蛋白-1(activatorprotein.1,AP-1)是血小板凝血酶敏感蛋白,也是TGF-β的主要激活物。現有資料證實,TGF-β促進膠原基因轉錄的分子機制與Smad家族的信號轉導有關。AP-1被激活后,促使TGF-β與其細胞膜上的受體結合,將活化的信號傳遞至細胞內,細胞內的Smad家族(smadl、2、3、4、6等)將信號進一步傳遞到細胞核內,激活核內轉錄蛋白,即轉錄信號轉導劑和激活劑(signaltransducerandactivatoroftranscription,STAT)-1,啟動膠原蛋白mRNA的轉錄,合成膠原蛋白。

4TGF-β1-Smads對肺泡-肺毛細血管屏障功能的影響

ALI的本質是各種損傷因素導致的肺泡-肺毛細血管屏障功能受損,肺毛細血管通透性增高的血管滲漏綜合征[29]。近年一系列文獻均證實,TGF-β呈劑量依賴性引起肺血管內皮細胞通透性增高[30,31,32]。為進一步探討TGF-β1引起肺血管內皮細胞屏障功能障礙的分子機制,一些學者進行了相關研究。發現TGF-β能調節細胞內多種信號途徑,如細胞外信號調節激酶(MAPK,如P38,JNK,ERK)、RhoGTPase、蛋白激酶C、磷脂酰肌醇-3-激酶等。其中RhoA是小G蛋白家庭成員之一,能調節細胞骨架和細胞間連接,導致應力纖維形成[30,33]。由于激活后的RhoA能產生許多生物學效應,包括細胞骨架的重構、轉錄因子的激活等,因此RhoA又被稱為肌動蛋白細胞骨架和細胞形態異質性的調節器。RhoA激酶拮抗劑Y-27632能部分減輕TGF-β1介導的內皮細胞通透性增高和細胞骨架的重構。2006年Lu[34]等證實TGF-β1通過SMAD2磷酸化激活P38,進而誘導RhoA活化和內皮細胞通透性增高,且TGF-β1對RhoA的激活有賴于P38的活化,因為給予P38活化特異阻斷劑能部分抑制RhoA的激活。同時Lu還發現,TGF-β作用后0.5-1小時SMAD2磷酸化達峰值,4小時后磷酸化水平下降。若應用SMAD2iRNA技術,那么TGF-β1所致內皮細胞通透性增高的效應則被逆轉,提示SMAD2在TGF-β1所致內皮細胞通透性增高機制中起主導作用。

5Smads信號通路對肺損傷纖維化的影響

Smads通路是TGF-β主要信號傳導分子,近年離體實驗表明,TGF-β1處理后肺成纖維細胞中膠原纖維產生明顯增多。為進一步探討TGF-β1上調Ⅰ型膠原的機制,Zawel[35]等發現TGF-β1處理后肺成纖維細胞Smad3,Smad4通路活化,進而啟動TGF-β1的靶基因collal,timp-1[35,36]的轉錄,導致Ⅰ型膠原的表達增多,從而部分揭示了TGF-β1促進ALI向ARDS和肺纖維化發展的機制。

Zhao等[37]研究了博萊霉素誘導的大鼠肺損傷模型中Smad2、Smad3的表達,發現Smad3mRNA在博萊霉素作用后第3天開始下降,一直持續到第8、12天,而Smad2基本保持不變。提示Smad3的表達在肺纖維化中可能起重要作用。一個更重要的發現是,將攜帶小鼠Smad7cDNA、Smad6cDNA的重組腺病毒分別通過氣管與博萊霉素同時進入兩組小鼠肺內,結果Smad7cDNA重組腺病毒作用組與Smad6cDNA作用組相比,I型前膠原mRNA的表達和羥脯氨酸的含量下降,并且沒有肺損傷纖維化的形態學變化;Smad7的表達可以抑制博萊霉素引起的Smad2磷酸化。提示Smad7而非Smad6可以阻止博萊霉素誘導的肺損傷纖維化。Smad7可能成為肺纖維化治療的一個突破點[38]。

Smad3基因缺陷小鼠和野生型小鼠分別氣管滴注博萊霉素,結果前者與后者相比,I型前膠原mRNA的表達下降,肺組織羥脯氨酸含量降低,而且從形態學觀察,Smad3的缺失相當程度上減輕了肺損傷纖維化。表明Smad3在博萊霉素誘導的肺纖維化中起一定作用,Smad3在肺損傷纖維化的治療中可能具有一定的實用性[37]。

總之,TGF-β1-Smads信號通路在ARDS發生、發展中具有重要作用,但迄今為止它在急性肺損傷纖維化疾病中的確切機制仍不十分清楚,特別時在不同誘因所致ARDS進程中,TGF-β與各種Smad蛋白表達的定時定位,不同Smad蛋白表達的意義,它們與其他信號通路是如何交叉,以及針對該通路的治療等方面,尚有待進一步研究。相信隨著研究的深入,對TGF-β及其信號蛋白的調控可能是今后ARDS治療新的有效靶點。