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1材料與方法
1.1實驗器械
鈦片（寶雞科迪普有色金屬加工有限公司），掃描電鏡（S-3400N,日本日立公司），倒置顯微鏡（XD-101型，南京江南電股份有限公司；超凈工作臺（蘇州凈化設備公司），離心機（TDL-40型，上海安亭科學儀器廠）；酶標光度儀（Bio-TekE1312E,USA），細胞計數板（浙江省玉環縣求精醫用儀器廠）。
1.2實驗材料
α-MEM培養基（海克隆生物化學制品有限公司），胎牛血請（杭州四季青公司），胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶（美國Sigma公司），二甲基亞砜（DMSO，捷瑞生物工程有限公司），MTT試劑盒（凱基生物科技發展有限公司，KeyGen），ALP檢測試劑盒（南京建成公司），波形絲蛋白抗體、角蛋白抗體、免疫組織化學試劑盒（武漢博士得公司）。
1.3實驗步驟
1.3.1鈦片的處理
光滑組與粗化組鈦片由西安寶雞科迪普有色金屬加工有限公司制備提供。具體方法如下：用直徑10mm純鈦棒線切割加工成厚1mm的圓鈦片，以金相砂逐級打磨至1200目，直至表面平滑、呈現灰白的金屬色為止，然后用丙酮、75％乙醇和去離子水在超聲清洗器（KQ250）輪流清洗15min,以除去材料表面機械加工而殘留的油污，40℃烤箱烘干，即得到光滑組鈦片。再以40目金剛砂噴光滑鈦片的表面，每試樣30片﹙樣本表面呈均一灰色﹚，進行上述同樣的超聲清洗后，40℃烤箱烘干，得到粗化組鈦片。鈦片的分組：鈦片經以上處理后分為4組：光滑組、粗化組、酸蝕組（同粗化組處理后用5.8mol/LHCl和8.96mol/LH2SO4混合液處理10min，雙蒸水沖洗，50％干燥）及雙氧水組（同酸蝕組處理后，8.8mol/LH2O280℃處理30min,400℃熱處理1h）。
1.3.2人牙周膜細胞﹙HumanPeriodontalCellshPDL﹚的原代培養及傳代
（1）組織來源：正畸需拔除的11～17歲青少年的雙尖牙（A、B、C、D四區均可），無炎癥、無齲壞的正常牙齒（貴陽醫學院附院頜面外科提供）；（2）細胞培養：取11～17歲青少年正畸需拔除的雙尖牙用生理鹽水沖洗3遍，放入加有10％雙抗的DMEM培養基中立即帶回實驗室，在超凈工作臺上用加入10％雙抗和10％甲硝唑的D-Hanks液沖洗3遍。然后將牙齒放入含0.1％Ⅰ型膠原酶（2ml）的青霉素小瓶中，在37℃孵育箱中消化1h并且每10min震蕩1次。終止消化后用吸管吹打牙齒根面，離心8min（1000r/min），加入含10％血清和1％雙抗的高糖的a-MEM培養基，移入培養瓶中并將培養瓶放入37℃CO2孵育箱中培養，鏡下見細胞貼壁后隔日換液；（3）hPDL的傳代：待細胞長至瓶底80％后，用25%的胰蛋白酶以1∶2消化傳代。
1.3.3hPDL的鑒定
取生長良好的第4代細胞做細胞爬片，1周后采用ABC法進行波形絲蛋白和角蛋白染色鑒定人牙周膜細胞。正常的hPDL來源于中胚層，抗波形絲蛋白陽性，而抗角蛋白染色陰性。
1.3.4hPDL的HE染色
取生長良好的第4代細胞做細胞爬片，1周后將爬片取出，丙酮固定后常規HE染色，光鏡下觀察并拍照。
1.3.5hPDL的接種
將處理好的鈦片置于12孔培養板內，取生長良好的第4代牙周膜細胞，0.25％的胰蛋白酶消化后調整細胞濃度至10×104/ml,取0.1ml該細胞懸液涂布于鈦片表面，6h后每孔加入1mlH-DMEM培養基，放入37℃CO2孵育箱中繼續培養。
1.3.6MTT法檢測材料的細胞毒性
取生長良好的第4代細胞，將其按1×104個接種到24孔板中，每孔培養液0.2ml，分為4組，每組20個復孔，細胞貼壁后第2天每孔加入MTT溶液0.5ml，離心后在37℃CO2孵育箱中繼續培養4h后棄去上清培養液，每孔加入1ml二甲基亞砜（DMSO），在搖床上震蕩15min，使結晶物充分溶解。選擇波長550nm，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，每組20個樣本求均值。
1.3.7鈦片表面hPDL數的測定
分別于接種后每天取出鈦片各20塊D-Hanks沖洗3遍，置入另一塊潔凈的24孔培養板內，胰蛋白酶消化2min，吸出胰蛋白酶，加入含血清的DMEM，每孔0.5ml。用吸管吹打鈦片表面，用血球記數板計數，將計算結果換算為每毫升懸液所含細胞數，每組重復計數4次。每天計數1次，共計數8d。
1.3.8hPDL的ALP活性檢測
取生長良好的第4代細胞接種（分為4組，每組20塊鈦片），每孔加入礦化液（1×10-2mol/LB甘油磷酸鈉、50mg/L維生素C、1×10-7mol/L地塞米松）培養2d，每孔加入0.1ml0.1％tritonX-100,4℃過夜。加入底物37℃培養30min，用0.1％NaOH終止反應。酶標儀測OD值，波長520nm。每組20個樣本求均值。測6d，以礦化時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制人牙周膜成纖維細胞的ALP活性圖。
1.3.9掃描電子顯微鏡（Scanningelectronmicroscope,SEM）觀察4種鈦片表面形態
取已經處理完畢的鈦片各1片（共4片）置于掃描電子顯微鏡下觀察其表面形態。實驗條件：加速電壓30kV，電流5×10-10，工作距離15mm。
1.3.10掃描電子顯微鏡（Scanningelectronmicroscope,SEM）觀察人牙周膜細胞在4種鈦片上的生長形態
將生長良好的第4代細胞接種在鈦片上培養3d，PBS沖洗3遍，戊二醛固定30min，自然干燥后噴金，掃描電鏡下觀察細胞形態并拍照。實驗條件：加速電壓30kV，電流5×10-10，工作距離15mm。
1.4統計分析
實驗結果選用SPSS11.0統計軟件包，數據用均值±標準差（x±s）表示，采用方差分析，P<0.05時差別有統計學意義。
2結果
2.1人牙周膜細胞的形態細胞呈梭形、多角形或星形，胞突細長，胞漿豐滿，細胞核1～2個，呈圓形或橢圓形。細胞密度較低時交織成網狀，細胞密度較高時排列成束狀或旋渦狀。見圖1和圖2。
2.2人牙周膜細胞的鑒定免疫組織化學實驗顯示細胞波形絲蛋白染色陽性，胞漿為棕黃色；角蛋白染色陰性，蘇木精復染后胞核呈紫色證明為中胚層組織來源。
2.3掃描電鏡下鈦片的表面形態
掃描電鏡照片清楚的顯示了四組鈦片樣本的表面形態差異（見圖5～8）。光滑組鈦片表面在電鏡下顯示出由于砂紙打磨造成的規則的環狀打磨線條，但是表面基本光滑，無明顯的凸起和凹陷；粗化鈦片表面非常粗糙，有非常不規則的不同形態的凹陷和尖銳的凸起；酸處理鈦片表面微孔較粗化組小且均勻；雙氧水處理鈦片表面出現多級孔洞的結構，并且表面的凸起和凹陷也較粗化鈦片及酸處理鈦片更為柔和，還可以看到表面有一些比較均勻的結節狀沉積層，鈦表面被完全覆蓋。
2.4細胞接種在4組鈦片上的掃描電鏡觀察細胞在4組鈦片上都能生長而且形態相似，都呈不規則的梭形。見圖9～12。
2.5MTT法檢測材料的細胞毒性取3份樣本讀取的平均值作為最后的實驗結果。計算細胞相對增殖率RCR％=實驗組OD值/空白對照組OD值。用5級毒性分級法評定材料的細胞毒性［4］。見表1。表1人牙周膜細胞的相對增殖率及材料毒性評級（略）
2.6細胞計數結果以培養天數為橫坐標，細胞計數為縱坐標繪制的細胞計數圖。見圖13。經統計學分析：第1天4組細胞的計數差異無統計學意義﹙P＞0.05﹚，從第2天到第8天差異有統計學意義﹙P＜0.05﹚。
2.7hPDL的ALP活性檢測以礦化時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制hPDL的ALP圖。從圖14可以看出，加入礦化液后第1天4組鈦片上hPDL都表現出了ALP活性，但是差別無統計學意義（P＞0.05）。在第2、3、4天4組的ALP活性處于波動期。到第5、6天ALP活性趨于穩定而且4組細胞的ALP活性差別有統計學意義（P＜0.05）。其中雙氧水組細胞的ALP活性最高（P＜0.05）。
3討論
3.1hPDL相對增殖率及材料毒性評級實驗結果顯示，光滑組細胞增殖率為80.94％，材料毒性評級1級，粗糙組細胞增殖率為114％，材料毒性評級0級；酸蝕組的細胞增殖率為123％，材料毒性評級為0級；雙氧水組細胞增殖率為140％，材料毒性評級0級。說明這4組鈦片表面毒性評級為無毒、低毒，都可以作為人體口腔種植材料。
細胞在4組鈦片上的增殖曲線顯示，細胞從第2天開始分裂增殖活躍，呈對數生長，到第7天細胞達到飽和密度時，細胞生長處于停滯狀態。細胞生長曲線呈滯緩-對數生長-平臺模式。統計結果顯示，4組細胞的生長及增殖有差異，而且雙氧水組細胞的生長及增殖最快（P＜0.01）。
3.2鈦片的表面形態對hPDL的影響
國外有學者通過研究光滑表面與粗糙表面人牙周膜細胞移行、黏附及排列的影響，得出粗糙表面有利于細胞的移行、黏附及排列［5］。在本實驗中，光滑組鈦片表面hPDL的相對增殖率為80.83％～81.06％，粗化組鈦片表面hPDL的相對增殖率為114％～115％，酸蝕組鈦片表面hPDL的相對增殖率為123％～124％，雙氧水鈦片表面hPDL的相對增殖率為140％～141％。粗化組、酸蝕組、雙氧水組都形成了不同程度的粗糙面，因此，這3組鈦片表面細胞的生長與增殖都明顯高于光滑組。而在這3組中，雙氧水組細胞的生長及增殖最快（P＜0.05），這個結果可能與雙氧水處理后鈦片表面能形成多級孔洞的結構有關。雙氧水處理鈦片表面是一種新的化學蝕刻方法，2005年何福明［6］等研究發現。雙氧水法處理鈦片后掃描電鏡觀察可以得到粗糙的表面，并形成明顯的多級孔洞結構。
3.3細胞在4種鈦片表面的ALP活性ALP活性是牙齒和骨等硬組織形成、代謝、再生過程中的重要礦化酶，同時ALP又是細胞分化成熟和成骨能力的重要標志酶，是前體細胞向骨化亞群細胞分化和向骨組織轉化的前提［7］。hPDL有向成骨細胞和成牙骨質細胞轉化的趨勢，ALP活性的變化可以顯示其向成骨細胞轉化的能力［8］。從人牙周膜細胞ALP活性圖可以看到，在加入礦化液以后，人牙周膜細胞在4種經不同方法處理的鈦片表面都表現出了ALP活性，并且都是達到峰值后下降并保持在一個相對穩定的水平，該結果可以說明礦化液對牙周膜細胞有成骨誘導作用。牙周膜細胞在適當的條件下可以參與礦化。其他學者的研究也證明，hPDL有向成骨細胞和成牙骨質細胞轉化的趨勢，ALP活性的變化可以給予hPDL一定的誘導條件后，細胞表現出成骨傾向，即約在20d左右可以觀察到礦化結節的出現，同時可以檢測到骨延蛋白和骨橋素在細胞礦化過程中的表達，而且hPDL的ALP活性是牙齦成纖維細胞的1.6～13.3倍［9～12］。本實驗的結果是在達到峰值后雙氧水組細胞的ALP活性保持在最高水平（P＜0.05），這可能與雙氧水處理后鈦片表面能誘導形成羥基磷灰石有關。因為傳統的粗化法和酸蝕法所形成的鈦片表面為無定形的TiO2層，無體外誘導磷灰石形成的能力。研究發現，雙氧水處理可以在鈦金屬表面獲得一層富含Ti-OH基團的非晶態TiO2層［13］。經過400℃熱處理后非晶態的TiO2結晶轉變為銳鈦礦晶相結構。2004年，Rohanizadeh等［14］的研究證實了銳鈦礦晶相結構表面更易誘導羥基磷灰石（hydroxyapatite,HA）結晶。經H2O2預處理組表面HA與鈦基體結合強度更高。