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作者：黃魯豫，胡蘊玉，陶惠人，畢龍，王軍，范洪斌，費正奇

【關鍵詞】辛伐他汀

摘要：［目的］探討辛伐他汀對體內破骨細胞功能及對局部骨吸收的影響。［方法］采用甲狀旁腺素相關肽（parathyroidhormonerelatedpeptide,pthrp）誘導的小鼠頭蓋骨骨吸收的動物模型體系，分別采用皮下注射辛伐他汀（0、5、10、20mg・kg-1・d-1）的方法，檢測頭蓋骨X線片的骨吸收面積，組織學用抗酒石炭酸染色（TRAP），檢測單位面積破骨細胞的數量。［結果］辛伐他汀在皮下注射（10、20mg・kg-1・d-1）均可抑制頭蓋骨的骨吸收和破骨細胞的形成，皮下注射（0、5mg・kg-1・d-1）則無明顯的抑制作用。［結論］辛伐他汀對小鼠局部骨吸收有著明顯的抑制作用，對局部骨吸收的治療有著重要的意義。

關鍵詞：辛伐他汀;甲狀旁腺素相關肽；骨吸收；動物模型

Abstract：［Objective］Toinvestigatetheeffectofsimvastatinontheosteoclastandthefocalresorptinofcalvariabone［Method］Animalmodelofcalvariaboneresorptionwasinducedbyparathyroidhormonerelatedpeptideinmice［Result］Simvastatinonthedoseof10,20mg/kg/dcouldinhibittheresorptionofcalvariaboneandtheformationofosteoclast,while,nosignificantinhibitionwasobservedonthelowdose(0,5mg/kd/d)［Conclusion］SimvastationcaneffectivelyinhibittheresorptionoffocalboneinmiceItmayprovideanimportantstrategyintreatmentofdiseasesinvolvedfocalboneresorption

Keywords：Simvastatin;Parathyroidhormonerelatedpetide(PTHrP);Boneresorption;Animalmodel

他汀類藥由于抑制了膽固醇代謝中甲羥戊酸途徑的羥甲基戊二酰輔酶A(3HydroxyMethylglutary1CoenzymeA，HMGCoA)還原酶活性，具有明顯的降血脂作用，目前是一種廣泛應用于臨床的降脂藥。1999年Mundy等〔1〕在篩選了3萬多種化合物后發現，他汀類藥是唯一能促進成骨細胞BMP2熒光報告基因活性的物質。進一步的研究表明他汀類藥可促進成骨細胞系MC3T3E1及大鼠骨髓細胞的堿性磷酸酶活性和骨質的礦化〔2、4〕，并且可促進骨質疏松大鼠新骨的形成。在正常生理條件下骨吸收與骨形成處于動態的平衡狀態中，一旦這種平衡被打破將可能會導致骨質疏松的發生。破骨細胞是骨吸收的功能細胞，其吸收功能的亢進與活躍在骨質疏松中具有重要的意義。盡管以往有研究表明，他汀類藥可通過促進成骨細胞BMP2基因的表達來促進骨生成，但其對正常成熟破骨細胞的骨吸收功能影響的報道甚少。本研究采用甲狀旁腺素相關肽（PTHrP）誘導的小鼠頭蓋骨有吸收的動物模型體系，探討辛伐他汀對體內破骨細胞骨吸收功能的作用及對局部骨吸收的影響。為闡明他汀類藥物對局部骨質疏松的防治作用提供新的理論依據。

1材料與方法

11材料

雄性4周齡BALB/C小鼠（購自第四軍醫大學試驗動物中心；清潔級二級），重組人PTHrP蛋白（美國GIBCO公司），辛伐他汀原料藥（simvastatin）(山東魯南制藥集團提供，生產批號：050502)。

12方法

121動物模型實驗

按甲狀旁腺素相關肽（PTHrP）誘導小鼠頭蓋骨骨吸收的動物模型體系〔5〕，用Hamilton注射器，于小鼠頭顱頂部左側，每天注射PTHrP2次，共注射5d，每次注射10μg/10μl，將小鼠共分為5組（每組7只）：Ⅰ組（治療對照組），于注射PTHrP前2d開始皮下注射1%DMSO/生理鹽水50μl；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組（PTHrP+Simvastatin），分別于注射PTHrP前2d開始皮下注射（5、10、20）mg・kg-1・d-1的1%DMSO/生理鹽水50μl，每天1次，共注射7d；Ⅴ組（空白對照組），皮下注射蒸餾水10μl，每天2次，共注射5d。24h處死，取材。

小鼠處死后，采集顱骨標本，使用FaxitronX線拍攝系統（型號43855，美國）拍攝X線片。用10%中性福爾馬林固定3d，脫鈣48h后，將顱骨前部沿冠狀縫，后部沿人字縫切除，中間部分切成2~3mm寬的小條，石蠟包埋，組織切片。切片作抗酒石酸染色后，再做HE染色。

122骨吸收的定量分析

X線片用數碼照相機翻拍后，保存為JPG彩色格式，使用LeicaQWin23圖像分析軟件分析顱骨冠狀縫到人字縫之間骨吸收面積，閾值通過選取5個典型骨吸收部位的色彩強度來確定。

123單位面積骨組織內破骨細胞數目

每

個標本取3張切片，做抗酒石炭酸染色（TRAP）后，再做HE染色。靠近骨組織且抗酒石炭酸染色陽性的巨核細胞為破骨細胞。在LeicoLA(德國)全自動顯微鏡和Pixaev數碼采集系統組成的圖像分析儀系統下采集圖像，分析自顱骨中縫向左側肌肉附著處（注射PTHrP的一側）6個05mm×05mm區域內破骨細胞數目和骨面積，計算單位面積骨組織內破骨細胞數目（圖1）圖1X線片種骨吸收的定量方法：使用LeicaQWin23圖像分析軟件，選用5個典型的骨吸收部位，測量其色彩強度后作為閾值，可以將骨吸收部位挑選出來，然后通過LeicaQWin23軟件自動計算人字縫和冠狀縫之間的骨吸收面積124統計學分析

SPSS10軟件系統行統計學分析，方法采用t檢驗。

2結果

骨吸收X線片下定量分析

Ⅰ組（治療對照組），皮下注射PTHrP2次/d，共注射5d，每次注射10μg/10μl，可形成明顯的露骨的骨吸收X線征象，Ⅴ組空白對照組則無顱骨的骨吸收征象；Ⅲ、Ⅳ組（PTHrP+Simvastatin）分別于皮下注射PTHrP前2d開始皮下注射（10、20）mg・kg-1・d-1的1%DMSO生理鹽水50μl，每天1次，共注射7d，其骨吸收面積及單位面積破骨細胞數目和Ⅰ組（治療對照組）相比均明顯減少；Ⅱ組于皮下注射PTHrP前2d開始皮下注射5mg・kg-1・d-1的1%DMSO生理鹽水50μl，每天1次，其骨吸收面積及單位面積破骨細胞數目和Ⅰ組（治療對照組）相比則無明顯減少（圖2、3，表1）。表1注射PTHrp和Simvastatin后骨吸收面積與單位面積內破骨細胞數目

3討論

31骨吸收性細胞因子誘導的局部骨吸收動物模型最初由BoyceBF等〔6〕人報告，Boyce在小鼠顱骨注射IL1，3d后顱骨有明顯的骨吸收，但11d后，骨吸收部位又逐漸被新生的編織骨所填充。陶惠人〔5〕等注射PTHrP于小鼠顱骨，5d后，產生明顯的骨吸收，并且較為穩定，易于重復，是作者進行骨質疏松研究的良好的動物模型。

32自1999年發現辛伐他汀的骨促進作用以來，大量的研究主要集中在對成骨細胞作用機制的研究，而辛伐他汀抑制破骨細胞骨吸收功能的作用目前報道甚少，尤其是辛伐他汀對體內破骨細胞的作用目前尚未見報道。最近劉波等〔7〕人報告了利用體外培養的方法，辛伐他汀體外可明顯抑制大鼠顱骨破骨細胞骨吸收陷窩的形成以及培養上清鈣的釋放。GrasserWA〔8〕等研究表明洛伐他汀對體外培養新生大鼠破骨細胞的形成和分化有著明顯的抑制作用，通過對甲二羥戊酸在破骨細胞發育代謝中作用的研究證實龍牛兒基龍牛兒醇在破骨細胞的形成和分化中起著重要作用。洛伐他汀對破骨細胞的抑制作用是通過關鍵異戊烯化蛋白的二牛龍牛兒基丙酮完成的，并且他汀類藥物骨效應是影響局部破骨細胞數量的重要因素。大量研究發現〔9、10〕，IL6的抑制物MadindolineA(MDLA)與gp130（為IL6的功能性受體之一）結合后，IL6的活性受到抑制，破骨細胞的生成及去卵巢大鼠的骨丟失也顯著被抑制，從而證明IL6在骨質疏松癥發病中的作用。辛伐他汀可降低外周血單核細胞IL6的表達水平。尤其是在用藥的6周以后血中IL6的濃度顯著降低。但是辛伐他汀對破骨細胞的具體作用機制還有待于進一步研究。VonknochF等〔11〕人在2005年1月報告了大鼠口服120mg・kg-1・d-1洛伐他汀可以抑制超高分子量的聚乙烯（UHMWPE）顆粒誘導的大鼠顱骨的骨吸收，并使局部破骨細胞數目減少。

圖2辛伐他汀治療小鼠顱骨骨吸收X線片：A對照組;B、C、D為不同劑量（5、10、20mg・kg-1・d-1scinjection）治療后的X線片圖3aPTHrP誘導的骨吸收;b經圖像處理軟件系統處理后，可自動計算出骨面積、破骨細胞數目及單位面積骨組織內的破骨細胞數目（Oc,N/TBA）33他汀類藥物抗骨質疏松有很大潛能，是目前發現的唯一能夠既促進骨形成，又抑制骨吸收的藥物，它通過很多途徑、多個環節來發揮抗骨質疏松的作用。本研究采用注射PTHrP誘導小鼠顱骨局部骨吸收模型體系，研究辛伐他汀對局部骨吸收的作用表明，辛伐他汀局部注射對局部骨吸收有著明顯的抑制作用，并存在著藥物的劑量依賴效應。通過對局部破骨細胞數目的觀察，發現辛伐他汀對局部骨吸收的抑制作用，是和抑制局部破骨細胞的形成和分化有關的。他汀類藥物可以全身應用有對骨質疏松的防治作用，本研究為局部骨吸收疾病如內固定松動、關節假體的松動等的預防和治療提供了局部治療的理論基礎。

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