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【摘要】根據(jù)鹽霉素生物合成途徑對其產(chǎn)生菌進行了推理選育。在常規(guī)誘變基礎(chǔ)上選用丁酸作為篩選劑檢出所需要的突變株，成功獲得三株高產(chǎn)菌株3233#、3244#和3250#，其效價比出發(fā)菌株F21#分別提高了34%、44.9%和39%。

【關(guān)鍵詞】鹽霉素；誘變劑；篩選劑；推理選育

Rationalscreeningforhighsalinomycinproducingstrain

ChuXiaohe1,2,WangPu1andSongYouli2

(1CollegeofPharmaceuticalScience,ZhejiangUniversityofTechnology,Hangzhou310032;

2ZhejiangShenghuaBiokBiologyCo.,Ltd.,Huzhou313220)

ABSTRACTAsalinomycinproducingstrain,namely#F21,wastreatedandmutatedusingphysicalfactorofUVandchemicalfactorofethylmethanesulfonate(EMS)respectivelywithreferencetotheinferentialscreeningtheory.Thepositivemutantswereobtainedfromtheplateswithbutyricacidforscreening.Threemostsbrandproductivestrainsof#3233,#3244and#3250werevalidatedin30m3fermentor.Theresultsshowedthatthetitresofmutant#3233,#3244and#3250were34%,44.9%and39%respectively,andhigherthanthatoftheoriginalstrain#F21.

KEYWORDSSalinomycin;Mutagen;Screeningreagent;Rationalscreening

鹽霉素(salinomycin)是由白色鏈霉菌(Streptomycesalbus)發(fā)酵產(chǎn)生［1］。日本早已證實鹽霉素有很廣的抗球蟲譜，對雞的柔嫩、毒害、堆型、脆弱、巨型和哈氏球蟲均有效，50mg/kg就有明顯抑制作用［2，3］。此外，鹽霉素對大多數(shù)革蘭陽性菌有抑制作用，對梭菌等革蘭陽性厭氧菌也有較強的抑制作用［4］。鹽霉素以其高效、低殘留、低耐藥性在世界幾十個國家獲得許可使用［5］。目前關(guān)于鹽霉素的研究主要集中在其應(yīng)用研究方面，對其菌種及工藝研究的報道較少。鹽霉素為典型的含聚醚鏈(polyetherchain)結(jié)構(gòu)的抗生素，通過乙酸和丙二酸的縮合進行生物合成［6，7］。鹽霉素為構(gòu)成聚醚鏈的丙二酸被甲基和乙基高度取代的線性脂族分子，沿著分子鏈有一系列的四氫吡喃環(huán)和四氫呋喃環(huán)［8］。研究表明，鹽霉素生物合成過程和其他聚醚系抗生物質(zhì)相同，即C2C4的脂肪酸直接進入鹽霉素合成，為6mol乙酸、6mol丙酸和3mol丁酸縮合而成(圖1)，其中丁酸為合成啟動子［9］。本文根據(jù)鹽霉素分子結(jié)構(gòu)和生物合成途徑，運用推理選育理論，通過選用丁酸R=CH3，甲基鹽霉素；R=H，鹽霉素作為篩選劑進行高產(chǎn)菌選育，為進一步工業(yè)化生產(chǎn)水平奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1出發(fā)菌株鹽霉素產(chǎn)生菌F21#由浙江升華拜克生物股份有限公司科研中心提供。

1.2培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)甘油18，酵母浸粉2.3，氯化鈉1.9，硝酸鈉1.1，瓊脂22；pH自然。

搖瓶種子培養(yǎng)基(g/L)蔗糖9.7，玉米漿25，磷酸二氫鉀2.0，豆油3.4，輕質(zhì)碳酸鈣1.1，酵母膏粉0.2；pH6.7～6.8。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖5.0，棉籽餅粉5.0，黃豆粉5.0，酒石酸銨5.0，輕質(zhì)碳酸鈣5.0，氯化鉀2.0，磷酸二氫鉀0.1，硫酸鎂1.0，氯化鈉0.1，豆油140；pH7.2。

種子罐培養(yǎng)基(g/L)蔗糖15.0，棉籽餅粉8.0，黃豆粉7.0，酒石酸銨5.0，輕質(zhì)碳酸鈣5.0，氯化鉀2.0，磷酸二氫鉀0.1，硫酸鎂1.0，氯化鈉0.3，豆油210；pH7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖25.0，棉籽餅粉15.0，黃豆粉15.0，酒石酸銨5.0，輕質(zhì)碳酸鈣6.5，氯化鉀2.0，磷酸二氫鉀0.1，硫酸鎂1.0，氯化鈉0.3，豆油240；pH7.2。

1.3實驗方法

(1)紫外線(UV)誘變刮取適量白色鏈霉菌的孢子于生理鹽水中，振蕩、打散孢子，經(jīng)過濾制成單孢子懸液，取6～8ml單孢子懸浮液放入滅菌的9cm培養(yǎng)皿內(nèi)，紫外燈下邊攪拌邊照射。紫外燈功率15W，照射時間分別為0、10、20、30和40s，照射距離為30cm。

(2)甲基磺酸乙酯(EMS)誘變用pH7.2磷酸緩沖液制成孢子懸浮液，吸取8ml孢子懸浮液放入帶蓋易密封小瓶中待用。用吸球及移液管吸取0.5ml的10mol/LEMS原液放入10mlpH7.2的磷酸緩沖液中制成0.5mol/LEMS溶液，再從0.5mol/LEMS溶液中吸取2ml放入盛放8ml孢子懸浮液帶蓋小瓶中，密封，置30℃培養(yǎng)箱中，每隔3mi

n振蕩1次。分別取不同時間的處理液，稀釋，涂布雙碟，計算死亡率、變異率(甲基磺酸乙酯的誘變效果與溶液質(zhì)量有關(guān)，而甲基磺酸乙酯不穩(wěn)定，易發(fā)生水解作用而生成有毒而無誘變作用的化學(xué)物質(zhì)，因此，其溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用)。

(3)篩選方法經(jīng)紫外或EMS誘變處理后的孢子懸液經(jīng)稀釋后涂布于含一定濃度丁酸的平板中進行分離，再挑取單菌落制作小斜面，搖瓶培養(yǎng)驗證效價。

(4)效價測定采用化學(xué)法［10］和高效液相色譜法。

在本試驗范圍內(nèi)，經(jīng)數(shù)據(jù)分析，高效液相色譜法(Y)與化學(xué)測定法(X)大致量的關(guān)系為：

Y=1.1074X-9.005(R2=0.9718)

(5)發(fā)酵及分析采用兩級發(fā)酵。種子培養(yǎng)條件33℃，230r/min，培養(yǎng)28h左右，30噸大罐放大三罐批，接種量10%，在33℃，230r/min發(fā)酵113～116h。實驗結(jié)果取3個重復(fù)的平均值。發(fā)酵液分析采用高效液相色譜分析［11］。

2結(jié)果與討論

2.1鹽霉素產(chǎn)生菌選育系譜

以F21#為出發(fā)菌株，經(jīng)2輪紫外誘變加丁酸篩選得到221#菌株，221#再經(jīng)EMS誘變和丁酸篩選得到3株高產(chǎn)菌株3233#、3244#和3250#。經(jīng)此過程處理后篩選得到的突變菌株221#、3233#、3244#和3250#即可進行發(fā)酵產(chǎn)量試驗。

2.2紫外線與EMS對鹽霉素菌株的誘變效應(yīng)

在采用丁酸作為篩選劑進行推理選育前，首先考察常規(guī)誘變即紫外線EMS對菌株的效應(yīng)。試驗結(jié)果表明，鹽霉素菌株經(jīng)紫外照射時間20s后存活率在10%以下，照射40s致死率為97.5%。EMS單獨處理鹽霉素菌株18s致死率達98%。在同一劑量的情況下，EMS對鹽霉素產(chǎn)生菌的誘變發(fā)生正變率大大高于負變率，但隨著EMS劑量提高，鹽霉素產(chǎn)生菌正變率也呈下降趨勢，故本實驗中EMS使用的劑量為1%。

2.3丁酸作為鹽霉素篩選劑的推理選育［12］

(1)UV誘變后丁酸篩選劑用量確定試驗在分析鹽霉素菌株代謝途徑的基礎(chǔ)上，以推理選育為基本理論，利用自然選育為對照，分別選取UV+丁酸0.4%、UV+丁酸0.6%、UV+丁酸0.8%對出發(fā)菌株進行選育，各挑取10個菌落進行搖瓶實驗(表1)，結(jié)果顯示，以丁酸作為篩選劑可以顯著提高鹽霉素效價，較自然選育結(jié)果分別提高了17%、34%和23%，故UV+丁酸0.6%為最佳劑量。我們在此劑量上選育出突變菌株221#進行下一步實驗。

(2)EMS+丁酸篩選劑試驗在選育出菌株221#后，同樣以自然選育為對照，在誘變劑EMS劑量1.0%條件下，分別采用含丁酸0.2%、0.4%和表1UV+丁酸篩選劑用量試驗0.6%進行選育，結(jié)果見表2。從結(jié)果可以看出，以EMS+丁酸0.4%效價為最高45600μg/ml，而丁酸劑量大于0.4%時發(fā)酵效價有下降的趨勢，但丁酸劑量為0.2%時效價不超過40000μg/ml，推測EMS和丁酸有一定的協(xié)同效應(yīng)，具體協(xié)同結(jié)果還需要進一步研究。經(jīng)此輪選育后，以自然選育為對照，同樣取平均值，結(jié)果顯示分別提高了23.4%、41.1%和25.8%。經(jīng)實驗證明，選用EMS+丁酸0.4%為最佳誘變劑量，在此基礎(chǔ)上選育出了高產(chǎn)菌株3233#、3244#和3250#。

(3)丁酸作為鹽霉素篩選劑的推理選育要選育高產(chǎn)菌株，除誘變劑作用外，還與篩選劑有關(guān)。本文根據(jù)鹽霉素的生物合成途徑的特點，選用丁酸作為篩選劑進行試驗。丁酸既是鹽霉素分子結(jié)構(gòu)組成單元，也是其生物合成途徑中的小分子前體物質(zhì)，同時又可作為鹽霉素發(fā)酵的有效碳源，可提高鹽霉素菌株發(fā)酵效價。丁酸作為啟動子還是鹽霉素合成不可缺少的組分，試驗結(jié)果表明，在含有丁酸作為篩選劑的平板上生長的菌株比在不含任何篩選劑的平板上生長的菌株，其發(fā)酵效價普遍有較大提高，因此選用丁酸作為鹽霉素高表2EMS+丁酸篩選劑用量試驗產(chǎn)菌株的篩選劑是合理的。

2.4發(fā)酵及其產(chǎn)物分析

經(jīng)過推理選育的菌株進行發(fā)酵產(chǎn)量試驗，我們采用221#菌株在30噸大罐上試產(chǎn)(三批)，221#菌株比出發(fā)菌株F21有較大的提高，與同期生產(chǎn)罐平均效價相比，效價提高了10%以上。同時，經(jīng)過出發(fā)菌株F21與最終篩選的菌株3233#、3244#和3250#發(fā)酵產(chǎn)量進行大批量生產(chǎn)比較試驗，F(xiàn)21菌株產(chǎn)量為32000μg/ml，而篩選后的菌株3233#效價為42940μg/ml，3244#為46360μg/ml，3250#為44460μg/ml，推理篩選的高產(chǎn)菌株分別比出發(fā)菌株F21#分別提高了34%、44.9%和39%。進一步對發(fā)酵液進行高效液相色譜分析(圖略)，結(jié)果顯示菌株3233#、3244#和3250#與出發(fā)菌株F21#發(fā)酵液相同，且峰面積比例均在92.95%～93.64%之間，成分比例非常接近，說明鹽霉素組分未發(fā)生變化，進一步證明了我們篩選的高產(chǎn)菌株代謝途徑未發(fā)生變化。

3結(jié)論

經(jīng)過實驗，我們主要得出以下結(jié)論：

(1)所獲三株高產(chǎn)菌(3233#、3244#和3250#)的效價比出發(fā)菌株F21#分別提高了34%、44.9%和39%，為進一步工業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

(2)推理選育證明，合適的篩選劑(丁酸)和誘變劑在高產(chǎn)菌株選育中有著同等重要的作用。3233#、3244#和3250#三株高產(chǎn)菌株選育是誘變劑和篩選劑——丁酸協(xié)同作用的結(jié)果。

(3)對高產(chǎn)菌株發(fā)酵產(chǎn)物分析證明組分未發(fā)生變化，但產(chǎn)物的表達量有較大幅度的提高，菌株的生物代謝途徑與出發(fā)菌株相同。

(4)本實驗所用篩選劑丁酸為鹽霉素生物合成的前體，其合適用量及恰當添加時間有待進

一步實驗。

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