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作者：劉仁旺，滕增輝，張邦樂，宦夢蕾，楊茜，周四元

【摘要】目的：建立同時測定白藜蘆醇和白藜蘆醇苷含量的高效液相色譜法，優(yōu)化虎杖中有效成分白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的提取工藝.方法：采用梯度法建立同時測定白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的高效液相色譜方法，以白藜蘆醇和白藜蘆醇苷總量為考察指標，設計以乙醇濃度、溶劑倍數(shù)及醇提溫度等為影響因素的4因素3水平的正交實驗，確定虎杖中上述有效成分的最佳提取工藝.結(jié)果：在選定的色譜條件下，虎杖提取物中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷可以達到基線分離.檢測白藜蘆醇及其苷的線性回歸方程分別為Y=0.0006X-0.183（r=0.9996），Y=0.0011X-0.478（r=0.9993）；線性范圍分別為0.48～38.4mg/L和0.47～38.2mg/L.日內(nèi)、日間精密度都小于5%，回收率在90%～105%之間，樣品分析時間小于7min.虎杖中有效成分白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的最佳提取工藝為乙醇濃度80％，溶劑倍數(shù)15，醇提溫度70℃，提取時間2h.結(jié)論：建立了準確可靠、分析速度快可同時檢測虎杖提取物中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的分析方法，優(yōu)化了質(zhì)量可控的提取工藝.

【關鍵詞】虎杖；白藜蘆醇；白藜蘆醇苷；高效液相色譜

0引言

虎杖(polygonumcuspidtumsieb)為蓼科蓼屬多年生草本植物虎杖的干燥根莖，主要含有蒽醌類、二苯乙烯類、水溶性多糖和鞣質(zhì)等成份［1］.白藜蘆醇(3,4′,5三羥基二苯乙烯)和白黎蘆醇苷是虎杖的主要功效成分，具有保護心臟、抗血栓、降血脂［2］等藥理作用.白藜蘆醇及白藜蘆醇苷的藥理作用相近，但其極性卻相差較大.本研究探討一種兼顧白藜蘆醇及白藜蘆醇苷的提取工藝，并建立同時測定白藜蘆醇和白藜蘆醇苷含量的高效液相色譜法（highperformanceliquidchromatography，HPLC），旨在為虎杖的藥理作用研究以及科學合理利用提供試驗依據(jù).

1材料和方法

1.1材料白藜蘆醇苷和白藜蘆醇的對照品均由中國藥品生物制品檢定所提供；虎杖的干藥材購自西安市胡家廟藥材市場.2695型高效液相色譜儀，2996型二極管陣列檢測器(美國Waters公司)；調(diào)溫式電熱套(北京科偉永興儀器有限公司)；色譜純乙腈，甲醇(美國TEDIA公司)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2方法

1.2.1工作曲線的建立分別精密稱取白藜蘆醇苷及白藜蘆醇對照品10mg置100mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成100mg/L的白藜蘆醇苷和白藜蘆醇對照品混合儲備液，備用.分別精密吸取兩對照品儲備溶液0.05，0.2，1，2,4mL配制成濃度為0.5，2，10，20,40mg/L的混合對照品的標準溶液，依次取20μL進樣.色譜條件為：色譜分析柱：C18(250mm×4.6mm，5μm，美國Phenomenix公司)；流動相：乙腈和水，梯度洗脫如表1所示.檢測波長：315nm；流速：1mL/min；柱溫為30℃.按上述色譜條件測定峰面積積分值，以峰面積積分值為縱坐標，對照品濃度值為橫坐標繪制工作曲線，應用Excel軟件采用最小二乘法計算回歸方程.

表1HPLC流動相梯度表

時間(min)〖〗乙腈(％)〖〗水(％)〖〗流速(mL/min)〖〗梯度類型0〖〗28〖〗72〖〗1.0〖〗67〖〗72〖〗28〖〗1.0〖〗69〖〗72〖〗28〖〗1.0〖〗620〖〗28〖〗72〖〗1.0〖〗1

1.2.2精密度和準確度測定分別精密吸取白藜蘆醇及白藜蘆醇苷儲備液0.1，0.5，3mL，配成濃度為1，5，30mg/L混合對照品的標準溶液.每個濃度6個樣本，連續(xù)測定3d，與標準曲線的建立同時進行.代入當日的回歸方程計算標準溶液的濃度，將結(jié)果進行方差分析，即得到本方法的精密度.將1，5，30mg/L三個濃度標準溶液的白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的測定濃度值與標準溶液的標示濃度相比，即得方法回收率.

1.2.3虎杖有效成分提取工藝的優(yōu)化在本生產(chǎn)工藝研究中，根據(jù)藥物有效成分、藥理作用及理化性質(zhì)特點，選擇醇提法進行正交試驗，以提取時間（A1,2,3h），乙醇濃度（B70%,80%,90%），醇提溫度（C50,60,70℃）和溶劑倍數(shù)(D10,15,20)作為考察因素，選擇3個水平，綜合評價提取工藝,選用L9(34)正交表，安排正交實驗.

取虎杖10g，按L9(34)正交表設計的順序，各加入設定的乙醇量，加熱煎煮規(guī)定時間和次數(shù)，濾過，合并濾液，將濾液用甲醇稀釋10倍后取樣20μL，用HPLC法測定白藜蘆醇及白藜蘆醇苷的峰面積，帶入回歸方程中，計算出白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的總量.

2結(jié)果

2.1HPLC檢測方法的特異性在本實驗選定的洗脫及檢測條件下，白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的保留時間分別為6.8min和4.7min.白藜蘆醇及白藜蘆醇苷峰和雜質(zhì)峰能實現(xiàn)基線分離，樣品峰的測定不受雜質(zhì)峰的干擾（圖1）.

2.2白藜蘆醇苷及白藜蘆醇標準曲線回歸方程以白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標建立標準曲線.應用Excel軟件采用最小二乘法得到白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的工作曲線回歸方程：Y=0.0006X-0.183（r=0.9996），Y=0.0011X-0.478（r=0.9993）.結(jié)果表明，白藜蘆醇及其苷分別在0.48～38.4mg/L和0.47～38.2mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關系.

2.3精密度和準確度測定1，5，30mg/L濃度的白藜蘆醇苷的日內(nèi)精密度分別為4.0%，2.6%和2.0%；日間精密度分別為4

.2%，4.3%和2.6%；方法回收率分別為（101±3.4）%，（94±2.3）%和（95±1.3）%.白藜蘆醇的日內(nèi)精密度分別為5.0%,3.0%和2.0%；日間精密度分別為4.8%，3.9%和1.1%；方法回收率分別為（96±5.1）%，（95±2.6）%和（95±1.6）%.結(jié)果顯示本方法準確、重復性好.

2.4虎杖有效成分提取工藝的優(yōu)化將測得值進行方差分析（表2），因素B差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01).由表3中進行直觀分析可知，A因素中各水平試驗結(jié)果的和比較為：K2>K1>K3，平均含量以第2水平為高；B因素中各水平試驗結(jié)果的和比較為：K1>K2>K3，平均含量以第1水平為高；C因素中各水平試驗結(jié)果的和比較為：K3>K1>K2，平均含量以第3水平為高；D因素中各水平試驗結(jié)果的和比較為：K2>K1>K3，平均含量以第2水平為高.選擇最佳的提取工藝為提取時間2h，乙醇濃度為70%，醇提溫度為70℃，溶劑倍數(shù)15.表2白藜蘆醇及其苷含量方差分析結(jié)果

3討論

近年來有較多關于虎杖有效成分白藜蘆醇和白藜蘆醇苷提取及含量研究的報道，多采用單因素、正交試驗及大孔吸附樹脂吸附法研究白藜蘆醇的提取條件［3-4］；正交試驗法及乙醇回流法優(yōu)選白藜蘆醇提取工藝［5-7］；以白藜蘆醇苷為指標，研究虎杖的提取條件等［8］，這些方法均以白藜蘆醇或白藜蘆醇苷單個成分為指標.由于虎杖中的活性成分白藜蘆醇和白藜蘆醇苷都具有保護心臟、抗血栓、降血脂等藥理作用，因此我們在本實驗中測定樣品中的白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的總量并以此作為評價指標是合理可行的.我們的實驗結(jié)果表明，正交試驗及方差分析結(jié)果虎杖醇提取工藝最大影響因素為乙醇濃度B，其次為溶劑倍數(shù)D，再次為醇提溫度C和提取時間A.最佳工藝乙醇濃度為80％，溶劑倍數(shù)為15，醇提溫度為70℃，提取時間為2h.

目前對虎杖中白藜蘆醇或白藜蘆醇苷的測定方法很多［9-10］，但是同時對白藜蘆醇及其苷測定的報道較少［11］，主要存在諸如樣品處理方法復雜、分析時間較長等問題.本研究建立的同時測定虎杖中白藜蘆醇及其苷的方法選用315nm作為檢測波長，使檢測方法獲得了較高的靈敏度.采用乙腈和水作為流動相，白藜蘆醇和白藜蘆醇苷與其他化合物達到基線分離.白藜蘆醇和白藜蘆醇苷分別在6.8min和4.7min出峰，快速有效地實現(xiàn)了分離檢測.

綜上所述，本研究建立的虎杖提取液中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的HPLC檢測方法具有靈敏、準確、迅速和工藝穩(wěn)定、經(jīng)濟等特點，可用于虎杖提取液中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量測定以及有效成分提取的質(zhì)量控制.

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