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肝臟是機(jī)體主要的代謝器官，病毒性肝炎、毒物、藥物等諸多因素可導(dǎo)致肝功能受損而影響其正常的代謝功能。肝功能出現(xiàn)障礙時(shí)，對(duì)機(jī)體代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)的清除能力下降，嚴(yán)重者甚至可引起肝昏迷。虎杖方劑由咸寧市南山肝病研究所歷經(jīng)數(shù)年收集民間治療肝病驗(yàn)方、經(jīng)方、單方、秘方根據(jù)中醫(yī)理論由虎杖、地榆、三白草等配伍蓬莪術(shù)按一定比例成方，用于防治病毒性乙型肝炎。本方劑中虎杖、莪術(shù)均有保肝護(hù)肝作用［1，2］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)一氧化氮（NO）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等在肝損傷中起重要作用［3］，并且發(fā)現(xiàn)莪術(shù)在較大劑量時(shí)對(duì)肝有毒性作用［4］。虎杖等對(duì)肝損傷時(shí)NO和TNF-α的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。為了保證臨床用藥的安全性和有效性，本實(shí)驗(yàn)就該方劑對(duì)四氯化碳致大鼠肝損傷的保護(hù)作用進(jìn)行了觀察。
1材料與方法
1.1動(dòng)物健康Wistar大鼠，體重180～250g，雌雄兼用。
1.2材料原生藥加蒸餾水浸泡1h后，煎煮1h和30min兩次，合并煎液進(jìn)行濃縮，得濃度為含生藥100％的溶液，冰箱保存；四氯化碳（CCl4），分析純，上海申鶴化學(xué)品有限公司產(chǎn)品，臨用前用麻油配成50％的溶液；谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒，上海生物制品研究所產(chǎn)品；SOD，MDA試劑盒，南京聚力生物醫(yī)學(xué)工程研究所產(chǎn)品；NO，TNF-α試劑盒，武漢博士德有限公司產(chǎn)品。
1.3實(shí)驗(yàn)分組參照文獻(xiàn)［5］方法建立大鼠肝損傷模型，60只Wistar大鼠分成6組，每組10只。正常對(duì)照組以生理鹽水灌胃（1ml/kg，2次/d，連續(xù)6d）；藥物對(duì)照組以藥物灌胃（1ml/kg，2次/d，連續(xù)6d）；肝損傷組以50％CCl4灌胃（1ml/kg，1次/d，連續(xù)3d），第4天用生理鹽水灌胃（1ml/kg，2次/d，連續(xù)6d）；藥物預(yù)防組為藥物灌胃（1ml/kg，2次/d，連續(xù)6d），第7天開(kāi)始用50％CCl4灌胃（1ml/kg，1次/d，連續(xù)3d）；藥物Ⅰ組以50%CCl4灌胃（1次/d）連續(xù)3d，第4d開(kāi)始用藥物灌胃（1.0g/kg，2次/d，持續(xù)6d）；藥物Ⅱ組以藥物灌胃2ml/kg，余同藥物Ⅰ組。
1.4生化測(cè)定與組織學(xué)觀察所有動(dòng)物于末次處理后2h斷頭處死、取血、分離血清，按試劑盒說(shuō)明用賴氏法測(cè)定血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性；用磷酸苯二鈉法測(cè)定血清堿性磷酸酶（AKP）活性；用酶聯(lián)吸附免疫法測(cè)定血清TNF-α水平；用硝酸還原酶法測(cè)定NO水平。同時(shí)取部分肝臟組織，用生理鹽水制成10％的組織勻漿，按試劑盒說(shuō)明測(cè)定SOD活性及MDA含量，另取肝組織用10％多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色，在光鏡下進(jìn)行組織學(xué)觀察。
2結(jié)果
2.1虎杖方劑對(duì)CCl4肝損傷大鼠血清ALT，AST，AKP活性的影響肝損傷組血清ALT，AST及AKP水平明顯高于正常對(duì)照組（P<0.01），表明CCl4肝損傷模型制作成功。藥物對(duì)照組與正常對(duì)照組比較，血清酶活性無(wú)顯著性改變（P>0.05），提示在實(shí)驗(yàn)給藥劑量時(shí)藥物本身不引起肝臟明顯損傷，對(duì)正常肝功能無(wú)明顯影響。無(wú)論預(yù)防性用藥還是治療性用藥，均顯著降低血清ALT，AST及AKP活性（P<0.01），其中以降低AST與ALT作用更明顯，結(jié)果表明藥物對(duì)CCl4肝損傷大鼠肝臟有保護(hù)作用。結(jié)果見(jiàn)表1。
表1虎杖方劑對(duì)大鼠血清ALT、AST及AKP活性的影響（略）
與正常對(duì)照組比較，1)P<0.01；與肝損傷組比較，2)P<0.01
2.2虎杖方劑對(duì)大鼠肝組織超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量的影響肝損傷組SOD水平顯著降低，MDA水平明顯升高，藥物治療組和預(yù)防組均明顯降低SOD水平，降低MDA水平，提示藥物能通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)對(duì)肝臟產(chǎn)生保護(hù)作用，減輕CCl4對(duì)肝臟的損傷。結(jié)果見(jiàn)表2。
表2虎杖方劑對(duì)大鼠肝組織SOD活性及MDA含量的影響（略）
與正常對(duì)照組比較，1)P<0.01；與肝損傷組比較，2)P<0.01
2.3虎杖方劑對(duì)CCl4致肝損傷大鼠血清NO與TNF-α水平的影響與正常組比較，肝損傷組血清NO和TNF-α水平顯著增高，治療組或預(yù)防組血清NO和TNF-α水平均明顯降低，表明虎杖方劑保護(hù)CCl4引起的肝損傷與抑制NO合成和分泌，以及抑制TNF-α的表達(dá)有關(guān)，結(jié)果見(jiàn)表3。
表3虎杖方劑對(duì)CCl4致肝損傷大鼠血清NO與TNF-α水平的影響（略）
對(duì)照組比較，1)P<0.01；與肝損傷組比較，2)P<0.01,3)P<0.05
2.4虎杖方劑對(duì)CCl4致肝損傷的組織學(xué)觀察光鏡下觀察，肝損傷組肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，肝索排列紊亂，肝細(xì)胞腫脹明顯，胞漿疏松，大部分肝血竇變窄，甚至閉塞不通，有淤血改變，壞死范圍大，呈橋狀或帶狀壞死。藥物治療組和預(yù)防組，病變較肝損傷組明顯減輕，肝細(xì)胞輕度濁腫，病變僅限于肝小葉周邊區(qū)，呈點(diǎn)狀或局灶樣壞死，多數(shù)肝血竇顯露，開(kāi)放通暢，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器數(shù)目和形態(tài)恢復(fù)接近正常，肝細(xì)胞增生活躍，雙核多見(jiàn)。
3討論
四氯化碳是一種對(duì)肝細(xì)胞有嚴(yán)重毒性作用的化學(xué)物質(zhì)，在體內(nèi)經(jīng)代謝產(chǎn)生自由基CCl3-，通過(guò)自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化作用破壞肝細(xì)胞器（如細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、溶酶體、細(xì)胞核），導(dǎo)致肝細(xì)胞變性壞死，轉(zhuǎn)氨酶大量漏出；同時(shí)四氯化碳可直接抑制肝臟微粒體混合功能酶［6，7］(如CYP1A1、CYP1A2、CYP2B1和CYP2E1等），最終引起肝功能受損而降低。另外，在自由基的作用下，可激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子（TNF-α）等，TNF-α參與炎癥反應(yīng)直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂。內(nèi)皮細(xì)胞在一氧化氮合酶（NOS）的作用下合成并分泌內(nèi)皮舒張因子一氧化氮（NO），合成NO的酶有兩種，即原生型和誘生型。原生酶合成的NO有舒張血管、傳遞信息、抑制血小板聚積等作用，而誘生酶合成的NO則與免疫及細(xì)胞毒有關(guān)，造成組壞死和細(xì)胞死亡，進(jìn)一步加重肝損傷。有研究表明［3］，誘導(dǎo)型NOS是肝臟的主要形式，并且TNF-α在肝臟炎癥反應(yīng)中起非常重要的作用。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，虎杖方劑能明顯對(duì)抗CCl4引起的大鼠肝損傷，其保肝護(hù)肝作用系通過(guò)虎杖中的白藜蘆醇苷和莪術(shù)中的莪術(shù)酮抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抑制TNF-α的表達(dá)和保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能產(chǎn)生，與文獻(xiàn)報(bào)道的一致［8］，而且該方劑本身對(duì)肝臟無(wú)明顯損傷作用。本實(shí)驗(yàn)還觀察到預(yù)防給藥對(duì)肝臟雖有保護(hù)作用，但不及治療組，其原因系藥物在體內(nèi)經(jīng)代謝和消除而使藥效降低。