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作者：趙領洲，張玉梅，魏艷萍，李健學

作者：晁曉東,費舟,張磊,李娟,仝武軍

【摘要】目的：克隆大鼠谷氨酸轉運蛋白3（eaat3）的cDNA，構建其真核表達載體并轉染Hella細胞.方法：從大鼠的腦組織中提取RNA,采用RTPCR技術擴增EAAT3的基因編碼區序列,將序列定向克隆至真核表達載體pcDNA3.1(+).經酶切及測序鑒定后用陽離子脂質體將其轉染到Hella細胞中，通過免疫印跡法鑒定其表達.結果:經雙酶切、測序鑒定證實EAAT3基因的真核表達載體構建成功.免疫印跡法證實EAAT3基因的表達.結論:成功克隆了EAAT3編碼區序列,并構建了其真核表達載體,為以EAAT3為基礎的中樞神經系統疾病的治療奠定了基礎.

【關鍵詞】載體蛋白質類;谷氨酸;真核表達載體

0引言

通常認為，細胞外液中沒有使谷氨酸（Glu）失活的水解酶系統.對從神經末梢釋放出來的Glu的清除和失活的唯一途徑是通過位于突觸前膜和神經膠質細胞膜上的興奮性氨基酸轉運體(EAAT)的攝取而實現［1］.目前，已克隆了5種EAAT［2］，分別是EAAT1，EAAT2，EAAT3，EAAT4和EAAT5.EAAT3主要分布在中樞神經系統海馬結構的CA1CA4區的錐體細胞層、齒狀回、小腦的顆粒細胞層及大腦皮質的ⅡⅣ［3］.最近研究證明EAAT3與主要的神經系統疾病，如肌萎縮性側束硬化癥、阿爾茲海默病、帕金森病、癲癇、腦缺血、外傷性腦損傷和精神分裂癥等有關，但具體機制尚不清楚.我們通過對大鼠EAAT3基因進行擴增、克隆及序列分析,為研究和防治由于EAAT3功能紊亂而導致的中樞神經系統疾病奠定基礎.

1材料和方法

1.1材料成年雄性SD大鼠1只，體質量350g，由第四軍醫大學實驗動物中心提供；真核表達載體pcDNA3.1(+)（Invitrogen公司）；感受態大腸桿菌TOP10，pGEMTeasy試劑盒（Promega公司）；Trizol及lipofection2000（Invitrogen公司）；QuantscriptRTKitcDNA第一鏈合成試劑盒、TaqPlusDNA聚合酶、DNA凝膠回收試劑盒及DNA提取試劑盒（TIANGEN公司）；限制性內切酶XhoⅠ，EcoRI及T4DNA連接酶（TaKaRa公司）；EAAT3抗體（美國Santacruz公司）；其它試劑為進口或國產分析純試劑.

1.2方法

1.2.1腦組織RNA的提取用10g/L戊巴比妥鈉按20mg/kg靜脈麻醉大鼠，斷頭取全腦，-70℃保存.取-70℃凍存的腦組織100mg，加入預冷至4℃的TrizolReagent1mL裂解細胞，用2mL勻漿器勻漿，靜置10min后將裂解產物轉移至微量離心管中，加1mL氯仿，振蕩15s，室溫靜置2～3min，4℃，12000g離心15min.取上清液移入新的微量離心管，加異丙醇2.5mL，輕輕混勻，室溫靜置5～10min，4℃，12000g離心10min.棄上清，加入750mL/L乙醇1mL，洗滌沉淀物，4℃，7500g離心5min.棄上清，將沉淀物在真空中干燥5～10min.用DEPC水15μL溶解沉淀，-70℃保存.取待測樣品2μL，紫外分光光度計比色法定量分析RNA含量.RNA實驗過程中，所有實驗用品均經DEPC處理，滅活RNA酶.

1.2.2引物設計根據GenBank中已報道的大鼠EAAT3cDNA(X94255)的基因序列設計合成大鼠EAAT3引物,上游引物:5′GAATTCGCCACCATGGGGAAGCCCACGAGCT3′,設有EcoRI酶切位點，下游引物5′CTCGAGCTAGAACTGCGAGGTCTGAGTGAAC3′設有XhoⅠ酶切位點.

1.2.3RTPCR擴增大鼠EAAT3cDNA根據TIANGEN公司試劑盒說明，用隨機引物反轉錄獲得EAAT3cDNA后進行PCR擴增.反應條件為預變性94℃5min,94℃30s，61℃30s，72℃90s，30個循環，72℃延伸10min.將PCR產物5μL在含溴化乙錠的10mL/L瓊脂糖凝膠電泳,用ImageMaster9.VDS電泳成像裝置觀察結果并拍照.

1.2.4目的基因克隆和酶切鑒定將PCR回收產物與pGEMT載體于16℃連接過夜，轉化大腸桿菌TOP10感受態細胞，在鋪有IPTG及XβGal的氨芐青霉素瓊脂糖平板上進行藍白菌落篩選,挑取白色陽性菌落,37℃過夜培養菌體.取菌液,提取質粒DNA,用EcoRI,XhoⅠ雙酶切.觀察EAAT3片段是否已克隆到pGEMT載體中.

1.2.5DNA序列測定挑選酶切鑒定正確的重組菌pGEMT/EAAT3,以重組質粒DNA為測序模板,由上海捷瑞生物技術公司測序.并用Sequence3.0分析軟件對測序結果與GenBank中的數據進行分析.

1.2.6大鼠EAAT2真核表達載體的構建將帶有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點的pGEMT/EAAT3雙酶切,純化回收酶切片段,同樣對pcDNA3.1(+)載體進行EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切純化回收,完全酶切后將pcDNA3.1(+)載體和EAAT3片段用T4DNA連接酶連接過夜,構建大鼠EAAT3真核表達載體pcDNA3.1(+)/EAAT3,將連接物轉化大腸桿菌TOP10,用Amp抗性篩選陽性克隆，提取質粒DNA.用EcoRI,XhoⅠ雙酶切、PCR方法鑒定所篩選的陽性克隆.將所克隆片段的序列在NCBI/GenBank數據庫進行Blast比對和分析.

1.2.7轉染hella細胞將Hella細胞常規培養于含100mL/L小牛血清的DMEM中，于轉染前1日收集細胞并接種于鋪有蓋玻片的六孔板中，細胞密度為6×105/孔.于37℃，50mL/LCO2培養24h，使每孔中細胞匯合達80%左右.按PolyfectTrans

fectionReagent說明書進行轉染，重組質粒各設3個復孔，每孔操作如下：將重組質粒1μg溶于100μL不含血清及抗生素的DMEM培養基中，加入20μLPolyfect，旋渦混勻.20℃～25℃靜置5～10min后，加入0.6mL含血清及抗生素DMEM培養基.吸出六孔板孔中的培養液，加入1.5mL含血清及抗生素新鮮DMEM培養基，迅速加入轉染復合物，輕輕搖勻，37℃，50mL/LCO2培養48h后檢測目的基因的表達.轉染同時另設空載體轉染對照和空白對照.

1.2.8免疫印跡法鑒定瞬時表達SDSPAGE后，用半干轉移儀將蛋白從凝膠轉移到硝酸纖維素濾膜(NC膜)上，用10mL50g/L的脫脂奶粉封閉.一抗為1∶100兔抗鼠EAAT3多克隆抗血清,二抗為1∶5000用過氧化物酶標記的兔抗山羊IgG.用增強化學發光蛋白免疫印跡法進行WesternBlot顯色分析.

2結果

2.1PCR產物的克隆及酶切鑒定

2.1.1RTPCR結果通過RTPCR得到一條大小1571bp的單一特異性條帶，與預期的EAAT3片段大小相符（圖1）.

1:DNAMarkerⅣ;2:EAAT3PCR產物.

圖1PCR產物的瓊脂糖電泳分析

2.1.2pGEMT/EAAT3重組質粒PCR及酶切鑒定對pGEMT/EAAT3經EcoRI,XhoⅠ雙酶切后,瓊脂糖電泳后顯現大小約1571bp的基因片段（圖2）.

1:DNAMarkerⅣ;2:pGEMT/EAAT3雙酶切.

圖2重組pGEMT/EAAT3質粒的EcoRI和XhoⅠ雙酶切鑒定

2.1.3pcDNA3.1(+)/EAAT3真核表達重組質粒PCR及酶切鑒定挑選陽性克隆，擴增并提取DNA.經EcoRI,XhoⅠ雙酶切鑒定，瓊脂糖電泳后顯現大小約1571bp的基因片段（圖3）.陽性克隆進一步進行PCR鑒定，經瓊脂糖電泳后出現目的基因片段，表明插入片段的存在.

1:DNAMarkerⅣ;2:pcDNA3.1EAAT3雙酶切.

圖3重組pcDNA3.1(+)/EAAT3質粒的EcoRI和XhoⅠ雙酶切鑒定

2.2陽性重組質粒的提取及質粒測序將初篩的2個陽性重組菌通過搖菌、質粒提取并純化,進行DNA測序,將測序結果與GenBank中大鼠EAAT3基因(X94255)的標準序列完全一致.

2.3WesternBlot鑒定轉染結果在轉染pcDNA3.1(+)/EAAT3的Hella細胞表達的重組蛋白可以被抗EAAT3抗體所特異性識別，其大小與預期相同，同時空載體組與空白對照組無條帶，表明EAAT3在Hella細胞中得到表達(圖4).

3討論

Glu是哺乳動物中樞神經系統內重要的興奮性神經遞質,可激活離子型受體和代謝型受體，參與神經元信號轉導及病理等生命過程［4］.釋放至突觸間隙的Glu主要由位于神經元和神經膠質細胞膜上的高親和力Glu轉運體重攝取而失活［5］,因此,EAAT對保持突觸間隙內Glu濃度在正常水平起重要作用，其主要功能是使Glu從突觸間隙和細胞外液被迅速轉運.它以跨細胞膜的Na+,K+和H+濃度梯度作為驅動力，轉運2個Na+和1個K+攜帶1個負電荷的Glu進入細胞內，同時有1個K+和可能加上1個OH-/HCO3-從細胞內轉移到細胞外作為交換，并至少有一個陽離子產生靜電效應，因此Glu轉運伴隨有電流產生.正常生理條件下，EAAT將Glu攝入到神經元和膠質細胞，這種攝入依賴正常的電位差，尤其是細胞內外的鈉離子梯度，使Glu在細胞內外的濃度差在1×103倍以上.

然而在很多病理情況下，EAAT抑制通過抑制反向轉運而減少Glu的釋放.帕金森病與EAAT3有很密切地相關性［6］；EAAT3表達水平在顳葉癲癇患者的病變組織中顯著升高［7］；在大鼠中樞神經系統損傷的研究中發現中樞神經系統的損傷與EAAT的下降明顯有關,但是在全腦缺血時EAAT3表達升高［8］；次聲損傷后，EAAT明顯下降［9］.Glu的濃度和位置的改變對神經系統的功能有著重要的意義，而它的攝取是其清除的主要途徑，盡管現在研究已經表明EAAT3的功能與蛋白激酶C等密切相關［10］，但具體機制尚不清楚.因此，我們的EAAT真核表達載體的構建為進一步了解和治療以其為誘因而導致的中樞神經系統疾病奠定了基礎.

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