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《醫(yī)藥導(dǎo)報雜志》2015年第十一期

尼可地爾(nicorandil)，化學(xué)名N-［2-(硝基氧基)乙基］-3-吡啶羧酰胺，屬于鉀通道激活劑，具有較強的冠狀動脈擴張作用，能增加冠狀動脈血流量，顯著減少心臟缺血事件發(fā)生。臨床常用于治療高血壓、冠心病及各類心絞痛，包括勞力型心絞痛和痙攣性心絞痛，并能改善運動耐力，長期服用可顯著改善預(yù)后，減少主要冠狀動脈事件或心血管死亡。《中華人民共和國藥典》(2010年版)尚未收載尼可地爾及其相關(guān)制劑，并且國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報道較少。口服藥物的主要吸收部位在小腸，藥物的吸收除了取決于其理化性質(zhì)外，還受腸黏膜構(gòu)造以及腸上皮細(xì)胞、腸內(nèi)酶對藥物代謝及屏障作用等影響［3］。因此研究藥物口服后吸收部位的特性及吸收機制是評價藥物及其制劑生物利用度的關(guān)鍵手段，并可作為研究開發(fā)口服劑型及新制劑的基礎(chǔ)。筆者在本實驗中采用大鼠在體腸道灌流法，研究尼可地爾在大鼠腸道的吸收特性及其吸收動力學(xué)，為尼可地爾劑型的合理設(shè)計提供生物藥劑學(xué)依據(jù)。

1材料

1．1實驗動物斯?jié)娎鄹?#8226;多雷(SpragueDawley，SD)大鼠，雄性，體質(zhì)量(250"50)g，購自華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，合格證號:SCXK(鄂)2010-0009，動物使用許可證號:SYXK(鄂)2012-0068。動物飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，溫度18～35℃，相對濕度45%～75%。

1．2藥品與試劑尼可地爾對照品(中國食品藥品檢定研究院，含量＞99%，批號:20120701);尼可地爾供試品(西安立邦制藥廠，批號:120917);酚紅(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號:20140424);甲醇(色譜純，TEDIA);水為雙蒸水;其他試劑均為分析純。Krebs-Ringer緩沖液(K氏液)，配方參考文獻(xiàn)［4］。空白腸循環(huán)液(配制好的K氏液經(jīng)腸循環(huán)裝置，在已沖洗干凈的大鼠腸道循環(huán)流過后收集即得)。

1．3儀器Agilent1200LC高效液相色譜儀(G1310A單元泵，G1312A二元泵，G1311A四元泵，G1316A柱溫箱，G1314AVWD檢測器，Agilent化學(xué)工作站);UV-1800型紫外-可見分光光度計(日本島津);HL-2恒流泵(上海滬西分析儀器廠);pHS-3CpH計(上海雷磁儀器廠)。

2方法與結(jié)果

2．1HPLC法測定腸循環(huán)液中尼可地爾濃度

2．1．1色譜條件色譜柱:AgilentSB-C18(4．6mm×250mm，5μm);流動相:甲醇-水(48∶52);檢測波長:254nm;柱溫:40℃;流速:1．0mL•min－1;進(jìn)樣量:10μL。

2．1．2標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備對照品溶液的制備:取尼可地爾對照品適量，精密稱定，置于100mL量瓶，用空白腸循環(huán)液溶解并定容，配制成0．101mg•mL－1尼可地爾對照品儲備液，4℃冰箱貯存?zhèn)溆谩９┰嚻啡芤旱闹苽?取尼可地爾及酚紅適量，精密稱定，用空白腸循環(huán)液溶解并稀釋，配制成尼可地爾濃度為20μg•mL－1、酚紅濃度為20μg•mL－1的混合供試品溶液。酚紅供試品溶液的配制:精密稱取酚紅適量，用空白腸循環(huán)液稀釋至刻度，配制成20μg•mL－1的酚紅供試液。

2．1．3系統(tǒng)適應(yīng)性實驗在上述色譜條件下測定，尼可地爾保留時間約4．77min(圖1)。空白腸循環(huán)液在尼可地爾峰位置處無干擾。供試品中尼可地爾分離度不低于1．5，理論板數(shù)以尼可地爾計不低于5000。重復(fù)性RSD為0．95%;日內(nèi)精密度RSD為0．79%，日間精密度RSD為1．3%、穩(wěn)定性RSD為0．63%，平均回收率98．2%，RSD為0．93%，方法學(xué)研究結(jié)果均符合要求。

2．1．4線性關(guān)系考察取尼可地爾儲備液，稀釋成系列濃度對照品溶液，按“2．2．1”項色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。以峰面積對尼可地爾濃度(μg•mL－1)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為A=4．3363C－1．3314(R2=0．9998)。結(jié)果表明，尼可地爾在2．02～60．60μg•mL－1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2．2腸循環(huán)液中酚紅濃度的測定

2．2．1測定方法腸循環(huán)液中酚紅的測定采用紫外分光光度法。在波長范圍200～600nm內(nèi)對酚紅溶液進(jìn)行掃描，酚紅在558nm處有最大吸收，其他成分在此處無吸收，對酚紅測定無干擾，故選擇558nm作為酚紅的測定波長。

2．2．2酚紅線性關(guān)系考察取酚紅適量精密稱定，加空白腸循環(huán)液稀釋，配制成系列酚紅標(biāo)準(zhǔn)液。分別取上述酚紅標(biāo)準(zhǔn)溶液0．5mL置10mL具塞試管，各加入0．2mol•L－1氫氧化鈉(NaOH)5mL，搖勻，用孔徑0．45μm微孔濾膜過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液，在波長558nm處測定吸光度(A)，以酚紅濃度(μg•mL－1)對吸光度進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程為:A=0．0135C－0．0039(r2=0．9998)。結(jié)果表明，酚紅在濃度范圍10～60μg•mL－1內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。其重復(fù)性RSD為0．75%;精密度RSD為0．88、穩(wěn)定性RSD為0．94%，平均回收率99．4%，RSD為0．51%，方法學(xué)研究結(jié)果均符合要求。

2．3尼可地爾大鼠在體腸道灌流實驗大鼠禁食、正常飲水18～20h。麻醉，背位固定在手術(shù)臺上，沿腹中線剪開腹腔;選取所需腸段，兩端剪口，插管扎緊;用預(yù)熱至37℃的0．9%氯化鈉溶液沖洗腸道，再通入空氣排凈0．9%氯化鈉溶液。先用尼可地爾供試品溶液以5mL•min－1流速循環(huán)10min，然后將流速調(diào)節(jié)為2．5mL•min－1;分別于不同時間點從供試液中分別取樣2和0．5mL作為尼可地爾和酚紅的待測液，隨即補充同濃度酚紅供試品溶液2．5mL;按前述方法測定各時間點尼可地爾峰面積值(采用外標(biāo)法)和酚紅吸光度值，按文獻(xiàn)［7］方法計算吸收速率常數(shù)(Ka)等動力學(xué)參數(shù)。

2．4尼可地爾大鼠腸吸收影響因素實驗

2．4．1不同濃度尼可地爾對大鼠小腸吸收的影響分別取尼可地爾濃度為10，20，40μg•mL－1、酚紅濃度為20μg•mL－1的供試品溶液。選取全腸段為考察腸段，按“2．3”項方法操作，每隔30min取樣，共取4h，結(jié)果見表1。對吸收速率常數(shù)進(jìn)行t檢驗，結(jié)果表明，在不同濃度時，Ka間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)，表明尼可地爾在10～40μg•mL－1濃度范圍內(nèi)吸收量隨濃度的增加而增加，無吸附飽和現(xiàn)象，而Ka無顯著變化，表明尼可地爾吸收以被動擴散為主。

2．4．2不同腸段對尼可地爾大鼠腸吸收的影響取尼可地爾濃度為20μg•mL－1、酚紅濃度為20μg•mL－1的供試品溶液。分別選取十二指腸、空腸、回腸及結(jié)腸為考察腸段，按照“2．3”項方法操作，每隔30min取樣，共取3h，結(jié)果見表2。各腸段Ka按空腸、十二指腸、回腸、結(jié)腸順序依次下降，對不同腸段Ka進(jìn)行方差分析及兩兩間多重比較，結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)，即空腸為藥物吸收的最佳部位，但該藥物在整個腸段均有較好吸收。

2．4．3環(huán)境pH值對尼可地爾大鼠小腸吸收的影響配制3份K氏液，調(diào)節(jié)pH值為6．0，6．8，7．4。配制成尼可地爾濃度20μg•mL－1、酚紅濃度20μg•mL－1的供試品溶液，選取空腸為考察腸段，按照“2．3．2”項方法進(jìn)行操作，每隔30min取樣，共取3h，結(jié)果見表3。對不同pH值條件下的Ka進(jìn)行t檢驗，結(jié)果表明在不同pH值時，Ka間均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。

3討論

本研究采用HPLC法測定腸灌流液中尼可地爾濃度，具有簡便、靈敏、可靠等特點，符合測定要求。腸灌流實驗中水分的吸收可明顯影響循環(huán)液中藥物濃度測定，不能準(zhǔn)確反映藥物吸收情況;而酚紅屬強酸性化合物，在小腸中多以離子型存在，不易被小腸吸收，故通過測定酚紅濃度來考察腸道對水分的吸收，并以此進(jìn)一步校正腸灌流液中藥物濃度數(shù)據(jù)。本實驗中，以小腸內(nèi)尼可地爾剩余藥量的對數(shù)lgD對時間t作線性回歸，所得相關(guān)系數(shù)均＞0．9，線性關(guān)系較好，可以認(rèn)為尼可地爾在大鼠小腸的吸收符合表觀一級動力學(xué)過程，吸收以被動擴散為主;且在不同藥物濃度、不同pH值環(huán)境下，吸收速率常數(shù)間均無顯著差異。藥物在不同腸段的吸收實驗發(fā)現(xiàn)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其吸收百分率按空腸、十二指腸、回腸、結(jié)腸的順序逐漸減小，藥物在整個腸段仍具有較好吸收;但此項結(jié)果仍需進(jìn)一步實驗驗證。一般而言，制備緩釋、控釋制劑的藥物需在腸道整段或較長部分具有較好的吸收，根據(jù)本研究結(jié)果，尼可地爾在整個腸段都有一定吸收，因此將尼可地爾研制成緩釋、控釋制劑可行。

作者：馮敏 杜娟 林寧 單位：湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院