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【摘要】目的：探討不同海拔的高原地區(qū)嚴重燙傷延遲復蘇后肺組織細胞凋亡及其基因調控機制.方法:雄性Wistar大鼠240只,分別在1517m和3848m海拔高度隨機分為延遲復蘇組(DFR,n=50),即時復蘇組(IFR,n=60)和對照組(n=10),建立總體表面積30%的Ⅲ度燙傷模型,分別于傷后1,6,12,24,72和168h取材.采用組織病理學、組織芯片技術、原位末端標記（TUNEL）法、免疫組織化學染色與圖象分析技術,觀察肺組織病理學改變與細胞凋亡及Bcl2和HIF1α的表達.結果:隨海拔的增加,肺泡壁明顯增厚,毛細血管內皮腫脹,肺泡腔中出現水腫液且有炎性細胞浸潤,DFR組較IFR組差異有統計學意義(P<0.05),肺泡上皮細胞凋亡逐漸增多,各海拔高度DFR組均較IFR組變化大(P<0.05).Bcl2與HIF1α的陽性表達均位于肺泡上皮細胞的細胞核或胞漿,其表達強度實驗組高于對照組(P<0.05),隨海拔梯度上升Bcl2表達增強,各海拔高度DFR組Bcl2表達強度高于IFR組（P<0.05）.細胞凋亡與Bcl2和HIF1α表達強度的變化呈正相關(r=0.872,0.945,P<0.05).結論:高原地區(qū)嚴重燙傷延遲復蘇大鼠肺組織細胞凋亡數量隨海拔梯度升高而增加,Bcl2和HIF1α對細胞凋亡具有調節(jié)作用.

【關鍵詞】燒傷；復蘇術；肺泡/細胞學；上皮細胞；TUNEL；HIF1α；組織芯片；免疫組化；高原

0引言

近年的研究表明,多種臟器在發(fā)生缺血再灌注損傷時會出現細胞凋亡［1-2］,但對于高海拔地區(qū)嚴重燙傷延遲復蘇后大鼠肺組織的細胞凋亡及其基因調控機制,尚無文獻報道.本實驗通過建立高海拔地區(qū)大鼠嚴重燙傷延遲復蘇模型,應用組織芯片技術［3-4］、原位末端標記技術、免疫組織化學染色和圖象分析技術,研究高海拔地區(qū)嚴重燙傷延遲復蘇大鼠肺組織細胞凋亡及其可能的調控機制.

1材料和方法

1.1材料健康雄性Wistar大鼠240只(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院動物實驗科提供),體質量(250±30)g,致傷前1wk,置室溫19～25℃.實驗前24h用電推推去背部被毛,單籠飼養(yǎng).實驗前12h禁食、水.10mg/L戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉,分別在中度高原(1517m)和高原(3848m)地區(qū)建立大鼠背部30%Ⅲ度燙傷模型(病理證實),致傷條件為90℃,20s.每一海拔梯度隨機分3組:即時復蘇組(IFR,n=60),即刻腹腔注射等滲鹽水4mL/kg;延遲復蘇組(DFR,n=50),6h后腹腔注射等滲鹽水4mL/kg;正常對照組(n=10),模擬燙傷,不補液.原位末端標記試劑盒:TUNEL(3%H2O2,檸檬酸緩沖液,TBS,封閉液生物素化抗體和地高辛抗體,DAB顯色劑等)由武漢博士德生物工程有限公司提供.HIF1α:兔多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司),工作濃度1∶100;Bcl2：鼠單克隆抗體(北京中杉生物工程有限公司)工作濃度1:100;SP試劑盒(北京中杉生物工程有限公司,武漢博士德生物工程有限公司);彩色病理圖文分析系統(同濟醫(yī)科大學千屏影像工程公司);組織芯片制作儀(朝陽恒泰科技發(fā)展有限責任公司).

1.2方法

1.2.1取材傷后1,6,12,24,72,168h,每組取10只動物,將大鼠處死,迅速開胸,于肺尖部切取0.5cm×0.5cm×0.5cm大小組織,10%甲醛固定,置4℃冰箱.對照組同上述方法.

1.2.2組織芯片的制備應用組織芯片制作技術制備42（6×7）點列陣的組織芯片,即由實驗組各時相點肺組織標本與相應海拔梯度對照組肺組織標本組成.具體操作如下:①所有標本經中性福爾馬林固定,56～58℃熔點石蠟包埋,3～4μm切片,經蘇木素伊紅染色,復核病理診斷,并在切片上標記出典型的病變區(qū)域;②用組織芯片制作儀的針孔芯針在無組織的空白蠟塊上鉆孔(直徑1.8mm);③借助玻片上的標記找準蠟塊上的相應部位,用組織芯針采集組織芯;④將組織芯轉移到空白蠟塊中相應的孔中,如此反復將數百個組織芯整齊有序安插在空白的蠟塊中,就制成了組織芯片蠟塊;⑤空位Marker選用兩個正常的肝臟組織,位于芯片的一角.

1.2.3病理學觀察將不同海拔高度實驗組、對照組肺組織標本石蠟包埋、切片、HE染色，顯微鏡下觀察照像.

1.2.4免疫組織化學分析采用SP法免疫組織化學染色,按試劑盒操作說明進行,DAB顯色,蘇木素復染.對照組用PBS液代一抗.免疫組化定量分析:每張切片隨機選5個高倍視野,測每個視野陽性信號平均灰度值.反應免疫組化染色越深,灰度越小,即陽性表達越高.

統計學分析:采用SPSS10.0統計軟件,計量資料用x±s表示;組間比較采用方差分析及LSDt檢驗;雙變量相關分析采用Pearson相關分析,α=0.05.

2結果

2.1組織芯片整體觀察42個點陣排列整齊,HE染色無掉片、重疊和扭曲現象,適合免疫組化染色的觀察和結果的判定.

2.2不同海拔高度肺組織細胞凋亡的變化與正常對照組比較IFR組與DFR組在各時相點表達均增強,主要分布在肺泡上皮細胞的胞核.定量分析示(表1):①DFR組與IFR組在兩個高度各時相點均高于對照組(P<0.05);②同一海拔高度,DFR組在6,12,24h時相點,其陽性表達強度均高于相對應的IFR組時相點(P<0.05);③高海拔DFR組與IFR組的表達強度,在6,12,24h時相點,強于低海拔DFR組與IFR組(P<0.05).

2.3不同海拔高度肺組織Bcl2的變化與正常對照組

比較,IFR組與DFR組在各時相點表達均增強,主要分布在肺泡上皮細胞的胞漿.定量分析示(表2):①DFR組與IFR組在兩個高度各時相點均高于對照組(P<0.05);②海拔1517mDFR組與IFR組相比,DFR組在6,12,24,72h時相點,其Bcl2表達強度均高于IFR組(P<0.05);海拔3848mDFR組與IFR組相比,DFR組6h陽性表達最明顯,IFR組于24h表達最明顯;③高海拔DFR組與IFR組的表達強度在6,12,24,72h時相點,強于低海拔DFR組與IFR組(P<0.05).

2.4不同海拔高度肺組織HIF1α的變化正常對照組比較IFR組與DFR組在各時相點表達均增強,主要分布在肺泡上皮細胞的胞核或胞漿.定量分析示(表3):①DFR組和IFR組在兩個高度各時相點均高于對照組(P<0.05);②同一海拔高度DFR組與IFR組相比,前者在6,12,24,72h時相點,其HIF1α表達強度均高于相對應的IFR組時相點(P<0.05)；③高海拔DFR組與IFR組的表達強度分別與低海拔DFR組與IFR組相比,在6,12,24,72h時相點,高海拔DFR組強于低海拔DFR組(P<0.05).表1兩個海拔燙傷后大鼠肺臟組織TUNEL標記細胞凋亡免疫組化灰度值的比較表2兩個海拔燙傷后大鼠肺臟組織Bcl2免疫組化灰度值的比較(表3兩個海拔燙傷后大鼠肺臟組織HIF1α免疫組化灰度值的比較

2.5相關性分析細胞凋亡與Bcl2間呈正相關(r=0.872,P<0.05)；細胞凋亡與HIF1α間呈正相關(r=0.945,P<0.05).

3討論

Bcl2是重要的抗細胞凋亡基因,在嚴重燙傷延遲復蘇后肺損傷中表現得尤為突出,本實驗顯示在海拔1517m,傷后12h在DFR組肺泡上皮細胞即出現凋亡細胞,與此同時,相應位Bcl2呈高度表達,表明肺臟組織在嚴重燒傷延遲復蘇后的肺泡上皮細胞可能是通過Bcl2的過度表達來發(fā)揮其抗凋亡作用,減輕細胞損傷.Bcl2抗細胞凋亡的作用機制可能與以下幾方面有關:①抑制Ca2+的釋放;②bc12通過阻止促進細胞凋亡基因信號傳遞或阻止這些誘導基因產物發(fā)揮作用;③細胞內抗氧化作用.也有研究表明,Bcl2抗氧化作用是間接的,即可能在于抑制超氧陰離子的產生而不是直接清除活性氧,而bc12的這種抑制超氧陰離子的作用與其能抑制細胞色素C的釋放有關.而在海拔3848m,傷后24hDFR組肺泡上皮細胞和中性粒細胞大量凋亡,相應位Bcl2的表達卻較弱,表明高海拔地區(qū)缺氧及缺血再灌注損傷更易引起肺組織細胞的凋亡,其機制為:①缺氧條件下Bcl2家族表達發(fā)生變化;②高海拔地區(qū)缺氧可通過降低Bcl2基因的表達來促進大鼠肺組織細胞凋亡的發(fā)生,這與司少艷等采用DNA降解、TUNEL法染色標記和Bcl2mRNA點雜交檢測大鼠在慢性缺氧時胸腺細胞的增殖能力,結果表明慢性缺氧可通過降低Bcl2基因的表達來促進大鼠胸腺細胞凋亡的發(fā)生相一致［5］;③Bcl2可抑制導致凋亡或壞死的活性氧形成,還通過調節(jié)質子流出而阻斷細胞凋亡;④缺氧誘導的凋亡主要是被抗凋亡蛋白過表達來阻滯的,并且是以劑量依賴性的方式作用.

HIF1α是一種隨細胞內氧濃度變化而調節(jié)基因表達的快速轉錄因子.我們實驗表明在高海拔地區(qū)嚴重燒傷延遲復蘇后,缺血、缺氧誘導了HIF1α的表達，提示HIF1α參與了不同海拔嚴重燒傷延遲復蘇后肺損傷的過程,促進了肺組織細胞的凋亡.目前認為,HIF1α表達增強,促進肺組織細胞凋亡的機制可能與低氧、缺血再灌注狀態(tài)下細胞線粒體產生大量的活性氧,以及與缺血再灌注后產生的OH有關,它們能夠穩(wěn)定HIF1α,使HIF1α免于被迅速降解.低海拔正常對照組HIF1α在肺泡上皮細胞不表達,是由于正常細胞在常氧環(huán)境中,HIF1α的半衰期極短,產生之后迅速被泛素化,繼而由蛋白酶溶解［6］.

綜上所述,不同海拔地區(qū)嚴重燙傷延遲復蘇后可以引發(fā)肺組織細胞壞死和凋亡,其細胞凋亡的產生可能與Bcl2和HIF1α基因蛋白的過量表達有關.

【參考文獻】

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