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本文作者：王鵬宋宗華李清果德安錢忠直畢開順單位：沈陽藥科大學藥學院沈陽國家藥典委員會北京中國科學院上海藥物研究所上海

在質量標準研究中,一項重要的工作就是要對質量標準中涉及到的分析方法進行方法學驗證,以保證所用的分析方法能夠準確可靠地控制藥品質量。5中國藥典62005年版一部新增了中藥質量標準分析方法驗證指導原則[1],該指導原則將范圍與線性分列,線性指測試結果與供試品中被測物濃度直接呈正比關系的程度,而范圍指能達到一定精密度、準確度和線性時,測試方法適用的高低限濃度或量的區間。原則中對需要驗證的分析方法與驗證的具體指標做了比較詳細的闡述,但中藥化學成分復雜,被測成分含量往往較低,且含量差異較大,考察范圍如何確定與其驗證方法目前尚無統一的說明。文中亦未涉及各具體指標在驗證時可接受的標準,國際上已頒布的指導原則中也未發現相關的要求[2]。本文以厚樸藥材為例,主要研究精密度、準確度和范圍的具體考察方法,為中藥質量標準分析方法驗證指導原則的修訂提供數據支持。

1儀器與試藥

Agilent1100系列高效液相色譜系統,Agilent1100高效液相色譜化學工作站;SARTORIUSCP225D型天平(德國賽多利斯公司);YB-1A真空恒溫干燥箱(天津市鑫洲科技有限公司);SZ-93A自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)。對照品厚樸酚(批號110729-200310)和厚樸酚(批號110730-200609)均購自中國藥品生物制品檢定所,供含量測定用;厚樸藥材經沈陽藥科大學孫啟時教授鑒定為厚樸MagnoliaofficinalisRehd1etWils;甲醇為色譜純(山東禹王實業有限公司);水為二次重蒸水。

2色譜條件

色譜柱:KromasilC18柱(416mm@200mm,5Lm);流動相:甲醇-水(78B22);檢測波長:294nm；流速:110mL#min-1;柱溫:35e;進樣量:5LL。在此條件下,厚樸酚、和厚樸酚色譜峰與相鄰峰之間分離度均大于115,峰形對稱,理論板數按厚樸酚計算不低于3800,色譜圖見圖1。

3溶液的制備

3.1對照品溶液的制備取厚樸酚對照品、和厚樸酚對照品適量,精密稱定,加甲醇分別制成含厚樸酚11125g#L-1、和厚樸酚01996g#L-1的對照品儲備液。分別精密量取厚樸酚、和厚樸酚對照品儲備液適量置50mL量瓶中,加甲醇制成含厚樸酚13510mg#L-1、和厚樸酚79165mg#L-1的混合對照品溶液。

3.2供試品溶液的制備取本品粉末(過三號篩)約012g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25mL,搖勻,密塞,浸漬24h,濾過,精密量取續濾液5mL,置25mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,即得。

4方法學考察

4.1線性關系考察精密量取對照品溶液015、110、210、410、810、10mL,分別置10mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,制成標準系列溶液,按上述色譜條件進樣分析,記錄色譜峰面積,以對照品濃度(C)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標,繪制標準曲線。厚樸酚回歸方程為:A=61786C-11764(r=11000);和厚樸酚回歸方程為:A=61686C-11008(r=11000)。結果表明:厚樸酚、和厚樸酚分別在61750~13510mg#L-1、31982~79165mg#L-1范圍內峰面積與質量濃度呈良好的線性關系。

4.2精密度試驗

4.2.1儀器精密度精密吸取低、中、高濃度混合對照品溶液(含厚樸酚濃度分別為61750、27100、10810mg#L-1;含和厚樸酚濃度分別為3198215193、63172Lg#mL-1),在上述色譜條件下,分別重復進樣6次,計算色譜峰面積RSD,厚樸酚分別為018%、019%、018%;和厚樸酚分別為019%、017%、110%。

4.2.2方法重復性考察¹制備同一濃度6份樣品的測定結果(n=6)。取同一批厚樸樣品約012g,精密稱定,按/3120項下方法平行制備供試品溶液6份,按上述色譜條件進樣分析,記錄色譜峰面積,計算厚樸酚、和厚樸酚的含量和RSD,結果見表1。º制備三個不同濃度共9份樣品的測定結果(n=9)。在10倍范圍內,按/3120項下方法平行制備低、中、高濃度供試品溶液,重復3次,按上述色譜條件進樣分析,記錄色譜峰面積,計算厚樸酚、和厚樸酚的含量和RSD,結果見表2。

4.3加樣回收率考察

4.3.1制備同一濃度6份樣品的測定結果(n=6)。稱取已知含量的厚樸樣品011g,精密稱定,共6份,每份分別精密加入厚樸酚對照品溶液2ml與和厚樸酚對照品溶液112mL,按/3120項下方法平行制備供試品溶液,按上述色譜條件進樣分析,計算加樣回收率,結果見表3。

4.3.2制備三個不同濃度共9份樣品的測定結果(n=9)。稱取已知含量的厚樸樣品011g,精密稱定,共9份,平均分為3組,每組分別精密加入對照品溶液適量,按/3120項下方法平行制備成低、中、高3個濃度的供試品溶液,按上述色譜條件進樣分析,計算加樣回收率,結果見表4。分別稱取已知含量的厚樸樣品0103g、011g、013g,各3份,精密稱定,共9份,每份分別精密加入對照品溶液適量,按/3120項下方法平行制備成低、中、高3個濃度的供試品溶液,按上述色譜條件進樣分析,計算加樣回收率,結果見表5。稱取已知含量的厚樸樣品0105g,精密稱定,共9份,平均分為三組,每組分別精密加入對照品溶液適量,按/3120項下方法平行制備成低、中、高3個濃度的供試品溶液,按上述色譜條件進樣分析,計算加樣回收率,結果見表6。0、2、4、6、8、12h進樣,按上述色譜條件測定,厚樸酚、和厚樸酚峰面積RSD分別為018%、017%,表明在12h內供試品溶液穩定。

5結果與討論

5.15中國藥典62005年版一部厚樸項下規定,本品按干燥品計算,含厚樸酚與和厚樸酚的總量不得少于210%。據文獻報道厚樸中這兩種成分含量差異較大[3,4],本文選取藥典規定低限的50%為最低點,擴大至10倍范圍,考察重復性和回收率。結果表明重復性RSD值隨考察范圍增大而增大,且同一濃度6份供試品溶液的測定結果與低、中、高濃度9份供試品溶液的測定結果方差非齊性(P<0105)。范圍擴大后,測得高濃度樣品含量降低,說明對于含量高的樣品存在溶劑不能提取完全的可能。回收率RSD值亦隨考察范圍增大而增大。當藥材取樣量不同,根據被測成分含量按1:1添加對照品時,誤差影響相對較小。而當確定相同取樣量,通過改變對照品加入量考察回收率時,發現當考察范圍擴大后,低濃度供試品溶液回收率明顯降低,9份樣品測定結果RSD明顯增大,加入對照品的量相對于藥材中原含量越少,回收率越低,所得RSD值越大。對照品加入量過低,相對誤差較大。建議中藥化學成分定量分析時建立分析方法適用范圍不宜過寬,對于含量相差較大樣品可進行稀釋后在適宜范圍內進行測定。

5.2重復性試驗結果顯示,RSD值隨考察范圍增大而增大,而樣品含量降低,但加樣回收試驗結果并未顯示相應范圍內回收率降低。說明直接添加對照品與從細胞中提取被測成分是兩個不同的過程,被測成分的提取過程會受到其他成分和細胞結構等的影響。

5.3中藥化學成分復雜,被測成分含量往往較低,且含量差異較大,考察范圍如何確定與其驗證方法目前尚無統一的說明。本文對范圍的確證進行了初步探討,在所建立的范圍內,考察6份和9份測定結果評價的差異和RSD值,研究9份評價高低濃度的選擇方法,對擴大考察范圍后的精密度和準確性進行評估,以期為中藥質量標準分析方法驗證指導原則的修訂和完善提供數據支持。