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1材料與方法

1.1材料姜黃素（Curcumin,CUR），羅丹明－123（Rhodamine-123，R-123）及MTT均為Sigma公司產品。鹽酸阿霉素（Adriamycin，ADR）為深圳萬樂藥業公司產品。DMEM培養基為Gibco公司產品。膀胱移行細胞癌株BIU-87，由北京醫科大學泌尿外科研究所饋贈；耐藥株BIU-87/ADR系由本實驗室通過采用遞增阿霉素劑量的方式誘導建立的呈典型MDR表型的耐藥細胞亞株。高表達P-gp。細胞在含0.5mg·L-1濃度的阿霉素、10%胎牛血清的DMEM培養基中以37℃，5%CO2條件培養，實驗前2d換無藥培養基培養。

1.2方法

1.2.1MTT實驗將處于對數生長期的兩種細胞分別以2×104/ml濃度接種于96孔培養板，每孔終體積200μl。上述條件下培養24h，小心吸盡每孔培養液。實驗組Ⅰ分別加入不同濃度的阿霉素、實驗組Ⅱ分別加入不同濃度的阿霉素加姜黃素（以終濃度0.1%DMSO助溶）。阿霉素終濃度分別為0.05，0.1，0.25，1.5，5(μg/ml)，姜黃素終濃度為25μmol·L-1。對照組Ⅰ為不加細胞僅含培養液的空白對照，對照組Ⅱ為不加藥物僅加細胞的陰性對照，以上述條件培養48h后，每孔加MTT(5mg/ml)液20μl，37℃繼續孵育4h，終止培養，小心吸棄上清液，每孔加150μlDMSO，振蕩10min使結晶物充分溶解。由空白孔調零后，以酶標儀檢測490nm處的光吸收值(A)。

細胞存活率(IC)=實驗組平均A值/陰性對照組平均A值

逆轉指數(RI)=IC50(BIU-87/ADR+ADR)/IC50(BIU-87/ADR+ADR+CUR)

1.2.2羅丹明外排實驗羅丹明作為P糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）的轉運底物能較好的代表其轉運功能［1,2］。將處于指數生長期的BIU-87/ADR細胞以2×104/ml接種于24孔培養板，每孔終體積1ml。上述條件下培養24h。小心吸棄培養液，加入羅丹明至終濃度為5μg·ml-1，上述條件繼續培養30min，吸棄培養液，加入不含羅丹明的培養液。實驗組Ⅰ僅含培養液和細胞，實驗組Ⅱ在Ⅰ的基礎上加入姜黃素至終濃度為25μmol·l-1，對照組為含細胞不加藥液組。分別于0，0.5，1.0，2.0h收獲細胞。細胞收獲方法為：吸棄培養液、0.25%胰酶消化、冷PBS(0℃)吹洗、離心(800r/min)3次后，500μl冷PBS吹散細胞，在流式細胞儀上檢測(激發波長480nm，發射波長540～660nm)，以熒光強度平均值（Mean）表示細胞內羅丹明濃度。細胞內羅丹明濃度以下式計算：A=實驗組平均熒光強度值-對照組平均熒光強度值。

1.2.3統計學處理實驗結果取3次實驗的均值，標準差均小于5%，組間顯著性差異用t檢驗。

2結果

2.1MTT試驗預試驗以姜黃素最高濃度25μmol·L-1作用兩細胞株48h，細胞存活率均在95%以上，排除了對細胞的毒性作用（見表1）。結果表明，姜黃素略增加阿霉素對BIU-87的細胞毒性作用(P＞0.05)；而對于BIU-87/ADR，姜黃素明顯增加阿霉素細胞毒性(P＜0.05)，逆轉指數為4.0。

表1細胞毒分析IC50（略）

*P＞0.05，**P＜0.01

2.2細胞內羅丹明濃度圖1為不同時間段細胞內羅丹明濃度的流式細胞儀檢測結果。可以看出，在每一時間點，姜黃素組R-123濃度均顯著高于無姜黃素組。姜黃素明顯抑制了細胞內R-123的外排(P<0.05)。

圖1R-123外排實驗（略）

3討論

盡管生物技術飛速發展，傳統醫學在世界的許多地方仍發揮著極其重要的作用。姜黃素是從姜科姜黃屬植物姜黃根莖中提取的一種酚類色素。姜黃素及其類似物和揮發油是姜黃主要活性成分，具有抗炎、抗菌、保肝、治療創傷、抗癌、抗病毒等活性。其抗腫瘤作用及機制正受到日益重視。

有文獻表明，姜黃素對人類惡性腫瘤細胞有誘導分化和增殖抑制作用［3，4］，近年研究表明，姜黃素可促進腫瘤細胞凋亡［5，6］，并且與阿霉素、絲裂霉素具有協同作用［7～9］；有人認為其具有化療增敏作用［10］。本實驗結果顯示，姜黃素可以有效逆轉膀胱腫瘤的MDR，姜黃素組BIU-87/ADR對阿霉素的敏感性是無姜黃素組的4倍。P-gp具有ATP依賴的生物膜泵功能，能將胞內藥物泵至胞外而產生MDR，R-123外排實驗結果提示，姜黃素直接抑制P-gp的外泵功能為其機制之一。諸多研究顯示，P-gp既可以單獨介導，亦可以參與介導膀胱腫瘤的MDR，是膀胱癌產生MDR的重要機制。由于膀胱癌是人類常見惡性腫瘤之一，具有易復發和產生MDR的特性，因此尋找其逆轉劑具有重要意義。維拉帕米、環孢素A等逆轉膀胱腫瘤的MDR已有多篇報道［11］，但未見關于植物藥的研究，我們的實驗無疑為逆轉膀胱癌MDR提供了一種新的方法。前述研究表明姜黃素發揮抑瘤效應需要較高濃度，系統用藥難以保持持續高濃度，膀胱癌術后，膀胱灌注化療是重要的治療手段，由于系局部用藥，因而具有較大的可行性。