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1材料與方法

1.1實驗方法

1.1.1DNA模板的制備取1mL過夜培養(yǎng)的副溶血弧菌菌懸液，19830×g離心2min，棄上清，沉淀按照細菌基因組DNA提取試劑盒（大連寶生物工程有限公司）說明，提取細菌基因組DNA。

1.1.2引物設計與合成以副溶血弧菌不耐熱溶血素tlh為目標基因序列，根據(jù)引物在線設計軟件設計PrimerExplorer4.0，在線設計一套LAMP引物，由寶生物工程（大連）有限公司合成，引物序列見表1。

1.2擴增體系

1.2.1lamp-hnb擴增體系反應體系25µL:10×反應緩沖液（NewEnglandBiolabs）2.5µL，dNTPsMixture（TaKaRa）1.4mmol/L，外引物F3/B3各0.2µmol/L，內(nèi)引物FIP/BIP各1.6µmol/L，MgS041.5µL，甜菜堿（Sigma）1mol/L，BstDNA聚合酶大片段（NewEnglandBiolabs）8U，細菌DNA模板2µL，HNB1µL（反應濃度150µmol/L）[2]，ddH2O補足至25µL，配置好混勻離心，于65℃溫育60min，80℃滅活10min，產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，同時肉眼觀察反應體系的濁度和顏色變化。

1.2.2PCR擴增體系反應體系25µL：包括10×PCRBuffe2.5µL（TaKaRa），MgCl22µL（TaKaRa），dNTP2µL（TaKaRa），上下游引物F3/B3各50nmol/L，DNA模板2.5µL，TaqDNA聚合酶0.3µL（TaKaRa），ddH2O補齊25µL。反應程序:預變性95℃5min；95℃30s；58℃30s；72℃45s；30個循環(huán)，72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.3特異性實驗LAMP-HNB和PCR方法對4株副溶血弧菌菌株和14株非副溶血弧菌菌株進行擴增，觀察實驗結(jié)果。

1.4靈敏度實驗

1.4.1基因組DNA靈敏度檢測用試劑盒提取副溶血弧菌基因組DNA，用酶標儀測定OD值計算DNA濃度，10倍比例稀釋DNA原液到10-1～10-9，同時進行LAMP-HNB和PCR反應。

1.4.2細菌純培養(yǎng)物靈敏度檢測取振蕩過夜培養(yǎng)的副溶血弧菌菌液，平板稀釋法計算菌液濃度，10倍比例稀釋10-1～10-8，用LAMP-HNB法檢測靈敏度，同時做PCR實驗。

1.4.3人工污染副溶血弧菌食品檢測取經(jīng)國標方法檢測不含副溶血弧菌的牡蠣樣品25g加入到225mL的NaCl堿性蛋白胨水中，用拍擊式均質(zhì)機均質(zhì)2min。取8mL均質(zhì)液加入已知濃度為1.4×108~1.4×10CFU/mL濃度梯度的副溶血弧菌純菌各2mL，各取1mL用試劑盒法提取DNA，提取DNA同時做LAMP檢測和PCR檢測。

1.5對市售海產(chǎn)品進行檢測從市場中采購海產(chǎn)品，其中包括帶魚、魷魚、海蠣子、花蜆子和多春魚等40份。采用無菌操作的方法取魚肉、魚內(nèi)臟、貝肉和蝦腹節(jié)肌肉等25g加入到225mL堿性蛋白胨水，均質(zhì)，(36±1)℃培養(yǎng)12~18h，接種到TCBS瓊脂上，挑選可疑菌落接種于3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板，36(±1)℃培養(yǎng)18~24h，按照GB/T4789.7—2013要求進行革蘭氏鏡檢、氧化酶實驗、嗜鹽性實驗、氯化鈉三糖鐵實驗等生化鑒定試驗，同時取1mL菌液按照（1.2.1）所提的方法，按照細菌基因組DNA提取試劑盒要求提取DNA用于LAMP-HNB和PCR實驗。

2結(jié)果與討論

2.1LAMP檢測方法的建立針對副溶血弧菌tlh基因設計特異性引物進行擴增，根據(jù)羥基萘酚藍指示劑的顯色原理，羥基萘酚藍（HNB）是一種金屬離子指示劑，Mg2+與HNB結(jié)合使得反應體系初始顏色為紫羅蘭色，隨著反應的進行，Mg2+與析出的焦磷酸根離子反應生成焦磷酸鎂沉淀，羥基萘酚藍失去了Mg2+使得體系顏色變?yōu)樘焖{色，而未反應的體系則仍保持著紫羅蘭色，以此判斷LAMP反應結(jié)果。如表2所示，LAMP-HNB發(fā)生擴增反應的反應管變?yōu)樘焖{色，而未發(fā)生擴增反應的反應管仍保持紫羅蘭色。如圖1、2所示，LAMP反應產(chǎn)物在瓊脂凝膠電泳上出現(xiàn)典型的LAMP反應階梯狀條帶，肉眼觀察反應管有較明顯的沉淀出現(xiàn)，PCR方法觀察反應結(jié)果在207bp處也有較明顯的條帶。

2.2特異性實驗如表3、4和圖3、4、5、6所示，4株副溶血弧菌菌株(1、2、3、14號反應管)LAMP和PCR反應均出現(xiàn)特異性擴增條帶，LAMP-HNB體系顏色為天藍色(1、2、3、14號反應管顏色為天藍色)，其他14株非副溶血弧菌（4~12、13、15~16號反應管）未出現(xiàn)特異性擴增條帶，LAMP-HNB仍保持紫羅蘭色（4~12、13、15~16號反應管顏色為紫羅蘭色），反應有較強的特異性。

2.3靈敏度實驗

2.3.1基因組DNA靈敏度副溶血弧菌基因組DNA濃度為5.45×106fg/μL，10倍比例稀釋進行LAMP檢測，如表5和圖7、8所示，從反應管顏色變化和凝膠電泳圖中可以判斷，LAMP-HNB檢測副溶血弧菌基因組DNA檢測限約為109fg。用同樣的基因組DNA進行PCR反應，當菌液濃度為5.45×103fg/μL時PCR反應不產(chǎn)生擴增條帶。因此，LAMP-HNB檢測副溶血弧菌純培養(yǎng)物的最低檢測限為PCR的100倍（1號空白反應管和9~11號反應管都為紫羅蘭色，2~8號反應管為天藍色）。

2.3.2副溶血弧菌純培養(yǎng)物靈敏度采用平板菌落計數(shù)法得原菌液濃度為1.4×108cfu/mL，把原菌液進行10倍比例稀釋，各稀釋梯度的菌液提取DNA進行擴增反應，如表6和圖9、10所示，LAMP-HNB發(fā)生擴增的反應體系顏色變?yōu)樘焖{色，而未反應的則為紫羅蘭色，LAMP-HNB方法檢測靈敏度為140cfu/mL，LAMP產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果與LAMP-HNB相同，PCR檢測方法的檢測靈敏度為1.4×103cfu/mL（1號空白反應管和8、9號反應管都為紫羅蘭色，2~7號反應管為天藍色）。

2.3.3人工污染副溶血弧菌的食品檢測人工污染副溶血弧菌的牡蠣樣品中的菌液濃度為2.8×107~2.8×100CFU/mL。如表7和圖16、17、18所示，人工污染副溶血弧菌的牡蠣樣品LAMP方法的最低檢出限為2.8×102CFU/mL，平行PCR方法的檢出限為2.8×103CFU/mL。

2.4市售海產(chǎn)品的實際檢測對市售海產(chǎn)品40份分別進行LAMP-HNB檢測、PCR檢測和國標方法檢測。其中LAMP-HNB法檢出15份為陽性，25份為陰性，PCR檢出15份為陽性25份為陰性，國標方法檢出15份為陽性25份為陰性，檢出率為38%。其中貝類的感染率最高，高達47%。以國標方法為標準，LAMP-HNB方法的檢出率符合率為100%。

3結(jié)論

LAMP-HNB方法用HNB判斷反應結(jié)果，隨著反應的進行，Mg2+與析出的焦磷酸根離子反應生成焦磷酸鎂沉淀，羥基萘酚藍失去了鎂離子使得體系顏色變?yōu)樘焖{色，而未發(fā)生反應的體系則仍保持著紫羅蘭色，以此判斷LAMP反應結(jié)果。LAMP-HNB方法檢測特異性強，對單增李斯特菌標準菌株等非副溶血弧菌的食源性致病菌行LAMP-HNB擴增反應，LAMP-HNB終反應體系為紫羅蘭色，對副溶血弧菌標準菌株進行LAMP-HNB擴增反應，反應體系變?yōu)樘焖{色，二者顏色差別明顯，可以較為準確區(qū)分。LAMP-HNB方法檢測靈敏度較高，對于基因組DNA的檢測限約為108fg，細菌純培養(yǎng)物檢測限約為140cfu/mL，這與徐芊、程曉艷[4]等報道采用LAMP檢測結(jié)果基本相符，同時低于祝孺剛、劉琦等報道的采用PCR檢測結(jié)果。

LAMP反應過程產(chǎn)生大量的焦磷酸鎂沉淀，可通過肉眼直接觀察，但較為難斷定。常用的判斷LAMP反應結(jié)果等方法有濁度分析、凝膠電泳和染料等。但是濁度分析和凝膠電泳法需要高昂設備和繁瑣操作程序，所以研究新型指示劑觀察反應結(jié)果在近幾年較為流行。現(xiàn)常用的染料主要有SYBRgreen、鈣黃綠素和HNB等。HNB和鈣黃綠素可以在LAMP反應前加入，有效的減少了反應污染的可能性，其它染料（如SYBRgreen）則需要在反應后加入，加重了污染的可能性，若通過反應前將指示劑滴加在蓋上，反應后彈入等方法則操作不容易控制。羥基萘酚藍（HNB）是一種金屬離子指示劑，原理是鎂離子與HNB結(jié)合使得反應體系初始顏色為紫羅蘭色，隨著反應的進行，Mg2+與析出的焦磷酸根離子反應生成焦磷酸鎂沉淀，羥基萘酚藍失去了鎂離子使得體系顏色變?yōu)樘焖{色，而未反應的體系則仍保持著紫羅蘭色，以此判斷LAMP反應結(jié)果。本實驗在反應前加入1µL（反應濃度150µmol/L）HNB染料觀察顏色變化判定反應結(jié)果，并同時將產(chǎn)物進行凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)二者結(jié)果相同，此結(jié)果與聶凱等人報道的應用HNB檢測甲型H1N1流感病毒，呂恒等人報道的應用HNB檢測大腸埃希菌結(jié)果相同，證明HNB有較強的準確性。副溶血弧菌廣泛的存在于海產(chǎn)品及沿海環(huán)境中，國內(nèi)外的報道中副溶血弧菌的分離率高達68.12%和78.6%，不同類別的海產(chǎn)品感染率不同，其中貝類副溶血弧菌污染較為突出，最高可達75%，本文在幾種海產(chǎn)品檢驗中也屬貝類的感染率最高，可以達到50%。人們在購買海產(chǎn)品時要合理安排好貯藏溫度和時間，防止交叉感染。在食用海產(chǎn)品時要盡量避免生食，要進行充分的熱處理，隔夜的餐食食用前要充分加熱，必要時可以加食醋調(diào)味殺菌。

作者：紀懿芳 胡文忠 姜愛麗 馮可 單位：大連工業(yè)大學 食品學院 大連民族學院 生命科學學院 大連理工大學 生命科學與技術(shù)學院