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《Chinese Journal of Analytical Chemistry雜志》2016年第10期

摘要：

采用頂空氣相色譜技術，建立了同時測定托比司他中6種殘留溶劑的方法。考察了不同固定相對分離效果的影響，優化了平衡加熱時間影響以及制樣溶劑。在優化的實驗條件下，采用Rtx-200型聚三氟丙基甲基硅氧烷為固定相的色譜柱(30m×0．25mm×1μm)分離、氫火焰離子化檢測器檢測、外標法定量的分析方案，實現了甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、1，4-二氧六環和吡啶6種殘留溶劑的同時分離與測定。6種溶劑在各自的線性范圍內線性關系良好，線性相關系數(R2)均大于0．998，定量限分別為甲醇0．006%、乙醇0．005%、二氯甲烷0．012%、乙酸乙酯0．0025%、1，4-二氧六環0．0076%、吡啶0．004%。在3個添加水平下，6種殘留溶劑的加標回收率在92．3%～100．3%之間，相對標準偏差為0．3%～3．6%。實際樣品分析結果表明，本方法簡單、快速、分離效果好，可用于托比司他中6種殘留溶劑的檢測。

關鍵詞：

頂空氣相色譜法;托比司他;殘留溶劑;同時測定

1引言

許多藥品在制備過程中會使用一些有機溶劑，當藥品中所含的殘留溶劑水平高于安全值時，將可能對人體或環境產生嚴重的危害。因此，對藥品中殘留溶劑水平的監測與控制，一直都是制藥領域重點關注的問題。1990年，歐盟、美國和日本在布魯塞爾啟動了“人用藥品注冊技術規定國際協調會”(ICH)，提出應頒布條令來考察藥品中殘留溶劑的含量，要求對所有藥品都要進行溶劑殘留的監測與控制［1，2］。托比司他是一個不含嘌呤結構的黃嘌呤氧化酶選擇性抑制劑，是由日本富士藥品株式會社研發的新一代抗高尿酸血癥和痛風的藥物［3］，并于2013年在日本獲得批準上市。不同于傳統的黃嘌呤氧化酶抑制劑(如非布司他)，托比司他主要與溶劑通道的關鍵氨基酸殘基發生相互作用［4］。托比司他(包括有關中間體)在其合成工藝中可使用到許多有機溶劑［3～6］，主要為甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、1，4-二氧六環和吡啶6種不同的溶劑。這些溶劑的毒性差異較大，殘留在藥品中會對人體健康造成危害。因此，建立簡單、快速、且能同時檢測多種殘留溶劑含量的方法對托比司他藥品的安全使用具有非常重要的實際意義。到目前為止，相關檢測方法尚未見報道。檢測藥品中殘留溶劑的方法有多種，常用的方法(如熱失重測定法)具有簡便、快速的特點，但通常得到的是所有殘留溶劑的總量;分光光度法是根據不同溶劑的特征吸收峰的強度而實現藥品中殘留溶劑的測定，但檢測靈敏度較低。目前，許多國家的藥典推薦使用靜態頂空氣相色譜法檢測藥品中的殘留溶劑［1，7，8］。該技術可將液體或固體樣品中的揮發性組分直接導入氣相色譜儀進行分離和檢測，適用于揮發性強的組分分析。而且頂空進樣法使待測物揮發后進樣，可免去樣品萃取、濃縮集集等前處理步驟，樣品處理簡單，工作效率高;同時，還可避免樣品中非揮發組分對色譜柱的污染，延長色譜柱的使用壽命。此外，頂空進樣一般取1mL揮發氣體，進樣體積顯著大于液體直接進樣方式，靈敏度也得到大幅度的提高［7］。目前，該技術主要應用在藥物殘留溶劑和水中揮發性組分的檢測方面，還可與質譜檢測技術聯用，用于分析中草藥、生物、食品包裝紙等樣品中的揮發性物質［9～12］。本研究利用頂空氣相色譜法，通過考察不同固定相對分離效果的影響、優化平衡加熱時間以及選擇合適的制樣溶劑，建立了同時測定托比司他中6種殘留溶劑的新方法，旨在為藥品中殘留溶劑的檢測及監控提供技術基礎。

2實驗部分

2．1儀器及試劑

AgilentTechnology7890AGCsystem氣相色譜儀，配有氫火焰離子化檢測器(FID)以及AgilentTech-nologiesG1888型頂空自動進樣器(美國Agilent公司);SGHK-500型氫氣、空氣發生器(北京東方精華苑科技有限公司);可調式移液器(法國Gilson公司);MetllerToledoXS204分析天平(瑞士Metller公司);20mL頂空進樣瓶。甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、1，4-二氧六環、吡啶均為色譜純(純度＞99．5%，Sigma-Aldrich公司);N，N-二甲基甲酰胺(色譜純純度99．9%，美國Fisher公司)。實驗樣品為某藥品公司生產的托比司他片劑(Topiroxostat，規格:20mg)。

2．2色譜條件

采用Rtx-200型聚三氟丙基甲基硅氧烷為固定相的毛細管色譜柱(30m×0．25mm×1μm;美國Restek公司)。程序升溫:初始溫度40℃維持6min，以10℃/min的速率升溫至240℃并維持2min;載氣為氮氣;FID檢測器，溫度:250℃;進樣口溫度:230℃;分流進樣方式;分流比:10∶1;柱流速:1．0mL/min;頂空平衡溫度:90℃，平衡時間:30min;進樣量:1mL。

2．3混合標準溶液的配制

分別精確稱取600mg甲醇、1000mg乙醇、120mg二氯甲烷、1000mg乙酸乙酯、76mg1，4-二氧六環和40mg吡啶，用N，N-二甲基甲酰胺定容至100mL，作為標準儲備液，4℃保存。儲備液用N，N-二甲基甲酰胺稀釋成系列工作溶液。在進行頂空氣相色譜分析時，通過測定單一標準溶劑的保留時間確定混合溶劑樣品的各個峰的歸屬。

2．4樣品制備

準確稱取供試托比司他片劑樣品0．20g(精確至0．0001g)，置20mL頂空瓶中，加入N，N-二甲基甲酰胺2mL溶解，立即密封。

3結果與討論

3．1色譜柱的選擇

甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、1，4-二氧六環和吡啶6種溶劑的極性存在著很大的差別。因此，為實現這6種溶劑的同時分離，需選擇合適的色譜固定相。本研究考察了3種負載不同固定相的毛細管色譜柱DB-FFAP(固定相:硝基對苯二酸改性的聚乙二醇)、ZB-624(固定相:6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷)和Rtx-200(固定相:聚三氟丙基甲基硅氧烷)對6種溶劑分離的影響，結果如圖1所示。使用DB-FFAP型色譜柱時，甲醇、乙醇和二氯甲烷分離效果差，同時乙酸乙酯、1，4二氧六環和吡啶拖尾較嚴重;使用ZB-624型色譜柱時，二氯甲烷、乙酸乙酯、1，4-二氧六環和吡啶分離效果很好，但是由于色譜柱對甲醇、乙醇的吸附作用較大，從而導致這兩種溶劑的色譜峰值較小甚至不出峰;使用Rtx-200型色譜柱時，6種溶劑均可得到良好的分離，且無拖尾現象。因此，選用Rtx-200型色譜柱對甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、1，4-二氧六環和吡啶進行分離。

3．2頂空平衡溫度與時間的選擇

由于頂空氣相色譜法是利用被測樣品(氣-液或氣-固)加熱平衡后，取其揮發氣體部分進入氣相色譜儀而進行分析，因此，平衡加熱溫度和時間是影響分析靈敏度與準確度的兩個重要參數。本研究所涉及的6種溶劑，沸點約在40～115℃之間，較低的溫度(如50℃)不僅平衡時間延長，而且會降低溶劑回收率;較高的溫度(如115℃)雖然有利于這些溶劑的揮發和縮短平衡時間，但會影響頂空自動進樣設備的壽命，并可能導致乙酸乙酯發生部分分解。并綜合考慮各方面因素，選擇加熱溫度為90℃，在該溫度下，乙酸乙酯不會分解，且各溶劑的揮發較快，平衡時間較短。在此基礎上，進一步考察了平衡時間15，20，25，30，35和40min對6種溶劑的色譜峰面積的影響。從圖2可見，甲醇、乙醇和乙酸乙酯在15～30min內色譜其峰面積隨著平衡時間的延長而增加，在30min以后峰面積增加趨于平緩;二氯甲烷、吡啶和1，4-二氧六環在15～40min內隨著平衡時間的延長，峰面積改變不大。為獲得良好的樣品分析的準確性和靈敏度，本方法選用平衡時間30min。

3．3溶劑的選擇

考察了四氫呋喃和N，N-二甲基甲酰胺作為溶劑的效果，發現四氫呋喃干擾乙醇的出峰，而以N，N-二甲基甲酰胺作為溶劑時，不僅可與甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、1，4-二氧六環和吡啶這6種溶劑互溶，而且由于其在色譜柱中最后出峰，不會在色譜分析時對分析物產生干擾，因此選擇N，N-二甲基甲酰胺為溶劑。

3．4線性關系、定量限及檢出限

用N，N-二甲基甲酰胺將6種標準儲備液分別稀釋成濃度為甲醇6．0～600．0μg/mL、乙醇5．0～1000μg/mL、二氯甲烷12～120．0μg/mL、乙酸乙酯2．5～1000μg/mL、1，4-二氧六環7．6～76．0μg/mL和吡啶4．0～40．0μg/mL的系列標準工作溶液，在上述優化的分析條件下進行測定。以峰面積(Y)對相應溶劑的質量濃度(X，μg/mL)繪制標準曲線，發現6種殘留溶劑在各自的濃度范圍內線性關系良好，線性相關系數均大于0．998。以S/N=3計算6種殘留溶劑的檢出限(LOD)，以S/N=10計算6種殘留溶劑的定量限(LOQ)，結果列于表1。

3．5回收率和精密度

根據《中華人民共和國藥典》2015年版第四部0861殘留溶劑測定法中的規定，相關6種殘留溶劑的限度值分別為甲醇0．3%、乙醇0．5%、二氯甲烷0．06%、乙酸乙酯0．5%、1，4-二氧六環0．038%和吡啶0．02%［2］。分別向藥品基質中加入限度值80%，100%，120%3個水平的目標分析物，進行實驗測定。結果如表2所示，待測物的平均回收率在92．3%～100．3%之間，相對標準偏差為0．3%～3．6%，可滿足實際分析要求。

3．6實際樣品分析

采用本方法對來自同一廠家的3批托比司他實際樣品進行了分析與檢測。圖3為其典型的色譜分離圖。在定量分析時，依據實際峰面積，采用外標法來進行。檢測結果列于表3。由表3可見，樣品中甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯可以檢出，但它們都低于《中華人民共和國藥典》的殘留溶劑的限度值，而乙醇、1，4-二氧六環和吡啶均未檢出。上述結果表明，這3批托比司他中的6種溶劑殘留符合我國藥典中的相關限度標準。本方法能夠滿足藥典中相應殘留溶劑的限量標準要求。

參考文獻：

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作者:馬博凱 高峽 劉偉麗 林雨青 單位:首都師范大學化學系 北京市理化分析測試中心