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《Chinese Journal of Analytical Chemistry雜志》2016年第10期

摘要：

采用分子排阻色譜和激發/多波段發射熒光檢測器，結合三維熒光光譜和平行因子分析，研究了新、老填埋垃圾滲濾液中溶解性有機質(DOM)的組成。實驗結果表明，兩種滲濾液來源的DOM均含有類蛋白和類腐殖質物質。在新填埋垃圾滲濾液中，類蛋白物質有4種存在形態，包括大分子蛋白質形態、高/低分子量腐殖質結合態和多肽/氨基酸形態;在老填埋垃圾滲濾液DOM中，類蛋白物質只有兩種形態，分別為大分子蛋白質形態和腐殖質結合態。相比于分子排阻色譜，三維熒光光譜結合平行因子分析能夠分辨出腐殖質和非腐殖質結合態的類蛋白物質，但不能有效區分蛋白質和以多肽/氨基酸形態存在的類蛋白物質。結果表明，三維熒光光譜結合平行因子分析和分子排阻色譜，可以表征DOM中不同形態分布的類蛋白和類腐殖質物質。

關鍵詞：

溶解性有機質;熒光光譜;分子排阻色譜;平行因子分析

1引言

溶解性有機質是環境中一類重要的物質，能夠為微生物提供營養和能量、介導微生物與氧化性物質之間的電子傳遞［1］、絡合重金屬［2］、以及吸附和增溶疏水性有毒有機物［3］，在陸地和水生態系統中發揮著重要的功能，因此成為研究熱點。DOM成分復雜，包含有蛋白質、多糖、氨基糖、核酸和腐殖質等多種物質，目前常用的分析方法包括紫外光譜［3］、熒光光譜［3，4］、紅外光譜［4，5］和核磁共振［5］。上述方法中，熒光光譜由于具有樣品預處理簡單、分析所需樣品量少、靈敏度高等諸多優點，成為研究DOM的最常用技術［6，7］。采用熒光光譜分析技術，可以將DOM分為不同類別的熒光組分［8］。然而，由于DOM是一大類組成和來源不同的混合物，其中許多物質存在結構相似的單元，不同物質的熒光圖譜可能相互重疊，給采用熒光光譜精確分析DOM組成和結構增加了困難［9，10］。為了降低DOM的異質性，減少不同熒光組分的重疊，研究者采用了一些數學方法如平行因子分析法［9］、主成分分析法［10］、自組織人工神經網絡法［11，12］和物理化學方法如色譜分離法［13］、樹脂分離法［14］，將DOM分成光譜圖和理化特性各異的組分單元［10，13］。在數學方法中，平行因子方法對DOM組分的分離效果最好、應用最廣泛［9，10］，但平行因子分析涉及復雜的數學程序，且組分數目的確定受到樣品數量的影響［10］。在物理化學分離法中，樹脂分離需要調節pH值，一定程度上改變了DOM組分的存在狀態，與天然實際環境中的DOM存在一定的差異;而色譜分離不需要調節pH值，能更好地反映DOM的實際分布情況和組分，但色譜分離所得組分數目也受諸多條件如洗脫液、洗脫方法等的影響［15，16］。因此，將數學分析和色譜分離兩種方法結合，充分利用兩種分析方法各自的優點，可以更有效和全面地揭示DOM的組成特征，目前尚缺乏這方面研究相關報道。基于此，本研究結合熒光光譜、分子排阻色譜和平行分子分析法，將DOM按不同的特性分組，探究其組成和結構特性。本研究結果可為DOM表征和地球環境化學行為預測提供科學依據。

2實驗部分

2．1儀器與試劑

MultiN/C2100型總有機碳分析儀(TOC，德國耶拿公司);F-7000型熒光光譜儀(日本日立公司);1200LC高效液相色譜(美國安捷倫公司);L-530離心機(湖南長沙湘儀離心機儀器有限公司);SHA-C水浴恒溫振蕩器(江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠)。HClO4、NaOH、Cu(NO3)2、Pb(NO3)2、CH3COONH4均為分析純。實驗用水為超純水。

2．2樣品采集與預處理

為了獲得具有代表性的樣品，在某生活垃圾填埋場，采集填埋年限不到1年的新鮮垃圾產生的滲濾液樣品S1和和填埋年限大于10年的陳腐垃圾產生的滲濾液樣品S2，12000r/min離心10min后，收集上清液，過0．45μm濾膜，收集濾液，濾液中有機物即為DOM。采用總有機碳分析儀測定DOM樣品中溶解性有機碳(DOC)含量，備用。2．3DOM的物理分離將所得DOM樣品的DOC調至6mg/L后，測定樣品的熒光光譜:PTM電壓700V，激發和發射波長狹縫寬5nm，激發波長200～400nm，發射波長280～500nm，激發和發射波長增量5nm，掃描速度2400nm/min。分子排阻色譜采用配有熒光檢測器的1200LC系統進行，所用分離柱和保護柱分別為PLaquage1-OH(50mm×7．5mm，8μm)和MIXED-M(300mm×7．5mm，8μm)(美國安捷倫公司)，洗脫液為pH=7的醋酸銨緩沖液，進樣量100μL，洗脫速度1mL/min。檢測器為激發/多波段發射波長的熒光檢測器，激發波長230nm，發射波長300～500nm，發射波長增量為1nm。2．4DOM的數學分離DOM三維熒光光譜的平行因子分析需要多個樣品，為了獲得多個樣品，制備DOC為6mg/L的DOM樣品S1和S2各18份，采用熒光猝滅滴定方法，分別加入Cu(NO3)2或Pb(NO3)2溶液，使DOM樣品中Cu2+或Pb2+的濃度依次為10，20，30，40，50，60，70，80和90μmol/L，將樣品在恒溫振蕩器上振蕩4h后，測定其三維熒光光譜，測定條件與DOM未加重金屬時

2．3節中的條件相同

將上述光譜數據扣除超純水光譜后導出，進行平行因子分析。平行因子分析方法如下:將樣品S1或S2的19種重金屬離子濃度為0～90μmol/L三維熒光光譜數據矩陣，在MATLAB2007上，采用的DOMFluortoolbox數據包(www．models．life．ku．dk)進行分析。首先是將DOM三維熒光光譜圖去除一次瑞利散射和二次瑞利散射，隨后經異常值檢驗、對半分析、核一致性分析、累計方差和分析及視覺檢驗［3，9，10］，確定樣品S1和S2可以各分離出4種不同的熒光組分，將所得組分在MATLAB上制圖。比較DOM經分子排阻色譜和平行因子分析所得組分數目和激發、發射波長，確定兩種分離方法所得組分的異同。

3結果與討論

3．1DOM的三維熒光光譜

圖1為DOM的三維熒光光譜，樣品S1在發射波長小于380nm的區域具有較高的熒光強度，而樣品S2在發射波長大于380nm的區域具有較高的熒光強度，綜合文獻［17～20］可知，發射波長小于380nm的區域為類蛋白物質，包括類色氨酸物質(發射波長小于325nm)和類酪氨酸物質(發射波長大于325nm)。一些與類色氨酸結構類似的多酚化合物，也在發射波長小于380nm范圍內產生熒光峰［21］，這些物質與類蛋白物質具有一個共同的特點，即均含有一個苯環結構。三維熒光光譜中發射波長大于380nm的為類腐殖質物質，這些物質含有兩個及以上的苯環結構，在類腐殖質物質中，一些帶有3個和4個苯環的物質，發射波長可能相同［22］。因此，可以推測，樣品S1主要為類蛋白物質，而樣品S2以類腐殖質物質為主，兩個樣品代表了兩類不同的DOM組成。在DOM中，不同熒光組分的熒光圖譜可能相互重疊［10，23］;此外，類蛋白物質可以以3種形態存在，包括多肽/氨基酸形態、腐殖質結合態和大分子蛋白質形態［8］，但圖1不能給出上述信息，需要采用物理和數學法對DOM熒光組分進行分離。

3．2DOM組分的物理法分離

分子排阻色譜主要是基于分子量大小不同將DOM分組，在分子排阻色譜中，大分子有機物先被洗脫出來，而出峰時間晚的為小分子有機物［15，16］，通過洗脫時間可以將DOM按分子量大小分為不同的組分。由于DOM是一大類有機分子的混合體，不同分子之間可以通過疏水作用、氫鍵和范德華力結合在一起成為大分子復合物，因此本研究中的大分子應為不同小分子通過一定作用力結合在一起的聚集體。在圖1中，由于激發波長230nm，發射波長300～500nm處的組分熒光強度較高，并且能代表所有的熒光物質，因此，在分子排阻色譜中，固定熒光檢測器的激發波長為230nm、發射波長為300～500nm、增量為1nm進行洗脫物熒光發射光譜測定。圖2a顯示出樣品S1含有4類物質，其出峰時間依次約為3．45，3．9，4．45和4．65min，以4．45min出峰處物質的熒光強度最高，顯示樣品S1含有4類分子量大小不同的物質，其濃度最高的為小分子有機物。從圖2a還可見，3．45和4．65min主要出現發射波長小于380nm的熒光峰，而3．9和4．45min在300～500nm范圍內均都出現了熒光峰，顯示3．45和4．65min處的組分主要為大分子蛋白質和小分子多肽/氨基酸形態存在的類蛋白物質，而3．90和4．45min處的組分主要為與腐殖質結合在一起的類蛋白物質［8］，并且其分子量小于蛋白質分子但大于氨基酸/多肽物質。樣品S2(圖2b)在3．30和3．85min處出現了兩個熒光峰，最大峰強出現在3．85min，出峰范圍為300～500nm，顯示其為類腐殖質物質。此外，在整個分離過程中，樣品S1和S2均在發射波長325～375nm范圍內均出現了較強的熒光強度，其究竟是由類蛋白物質引起，還是噪聲引起，還需要進一步鑒定。本研究采用色譜柱分離法與樹脂分離類似，它們均能降低混合物的異質性，He等［14］采用XAD-8大孔吸附樹脂將DOM分類出了不同親疏水組分，但是這種分離方法基于pH值調整到酸性范圍后DOM分子上極性官能團的差異，而本研究采用色譜分離，是基于分析物分子量大小的差異進行分離。

3．3DOM的數學法分離

圖3為樣品S1經平行因子分析所得的4個組分。組分1有兩個熒光峰，其激發波長為230nm，發射波長為280/340nm;組分2也有兩個熒光峰，其激發波長分別為230和280nm，發射波長位于325～340nm范圍內，以上兩個組分在發射波長大于380nm范圍內也存在較強的熒光發射。由文獻［8］可知，組分1和2為腐殖質結合態存在的類蛋白物質;組分3有一個尖峰和一個肩峰，其激發波長分別為230和250nm，發射波長均為300nm，屬于類色氨酸物質;組分4有3個熒光峰，其激發波長分別為220，250和315nm，發射波長均為425nm，屬于類腐殖質物質［7］。組分1和2對應于樣品S1分子排阻色譜中3．90和4．45min出峰的物質，均為腐殖質結合態存在的類蛋白物質［8］;組分3對應于樣品S1分子排阻色譜中3．45和4．65min出現的類蛋白物質［17］，但組分4在分子排阻色譜中沒有對應的物質，其是否為實際組分還不得而知。如圖4所示，樣品S2經平行因子分析得到4個組分，其中組分1有兩個熒光峰，其激發波長分別為240和320nm，發射波長為410nm，參照文獻［8］，組分1為類腐殖質物質;組分2也有兩個熒光峰，其激發波長分別為235和280nm，發射波長在335～375nm范圍內，為類蛋白物質［17］;組分3含有3個熒光峰，其激發波長分別為225、280和360nm，發射波長為440nm，為類腐殖質物質［17］;組分4含有兩個熒光峰，其激發波長均為225nm，而發射波長不同，此類物質尚未見到相關報道。與樣品S2的分子排阻色譜相比，組分1對應于分子排阻色譜中的3．85min的類腐殖質物質，組分2和3在樣品S2的分子排阻色譜中并未見對應的物質，組分4在樣品S2的色譜圖中一直存在，顯示分子排阻色譜中發射波長325～375nm范圍內均出現的熒光強度對應于某種物質，可能為3．3min出現的類蛋白物質。對比DOM經分子排阻色譜和平行因子分析所得的組分發現，二者既有相同之處，有互相對應的物質，又有不同之處，顯示物理分離和數學分離各有各自的優缺點。由于不同有機分子之間可能通過疏水作用、氫鍵和范德華力結合在一起［15，24］，因此，分子排阻色譜并不能將所有分子分開;相比較而言，平行因子分析可以將這些組分分開而不受到上述作用力的影響。但是很多情況下，平行因子分析并不能有效揭示兩種物質之間是共存關系還是單獨存在;此外，平行因子分析不能區分以大分子蛋白質形態存在和小分子多肽/氨基酸形態存在的兩種類蛋白物質，因此，將分子排阻色譜和平行因子分析聯用可以更加全面表征DOM組成情況，減少其復雜性和異質性。

4結論

分子排阻色譜能有效分析DOM中不同物質的分子量及其形態，可以將DOM分為小分子多肽/氨基酸、中等分子的腐殖質以及大分子蛋白質;平行因子分析可鑒別分子排阻色譜中未分開的組分，并且能給出不同組分激發/發射波長的詳細信息，但平行因子分析不能分開蛋白質和氨基酸/多肽形態的類蛋白物質。結果表明，熒光光譜結合平行因子分析和分子排阻色譜，能有效、全面地表征DOM的組成。

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作者:鞏學勇 張宏志 侯超 王玉民 董建 單位:泰山醫學院 化工學院