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《茶葉科學雜志》2016年第二期

摘要：

在探明湖南省冬夏兩季茯磚茶發花期間真菌種群的生長特性及演替規律的基礎上，試驗對分離鑒定的27株真菌微生物開展了不同培養基、碳源、氮源、溫度等生物學特性研究，探討不同菌株菌絲生長及產孢的情況。結果表明，所有的發花微生物均能在茶汁培養基上生長，在不同碳、氮源的培養基上以單糖、二糖和有機氮源為碳、氮源的培養基上菌絲生長較快且利于產孢，發花微生物生長的最適溫度為25~30℃，超過30℃或低于25℃將會抑制生長。但不同發花微生物個體之間又存在著一定差別，表明不同季節茯磚茶發花微生物的種類和演變規律與發花微生物自身的生物學特性存在著緊密聯系。

關鍵詞：

茯磚茶；發花微生物；生物學特性

茯磚茶是一種緊壓黑茶，具有顯著的消滯減肥作用[1-3]。近年來，隨著人們生活水平的提高，膳食結構的變化，茯磚茶的消費區域不斷擴大、需求量在快速增長[4-5,12-13]。茯磚茶以黑毛茶為原料，經過篩切、拼配、汽蒸渥堆、壓制、發花干燥等一系列工藝制作而成。其中，“發花”是茯磚茶加工過程中特有的工序，通過精確控制烘房內的溫、濕度等環境條件，促使目標有益菌——冠突散囊菌的生長繁殖，以產生大量的金黃色的閉囊殼，俗稱“金花”[4]，茯磚茶中“金花”的質量和數量是評價產品質量的關鍵。研究表明，在發花過程中，由于溫、濕度適宜，茶坯中的各種微生物相繼迅速繁殖，經過一段時間隨著茶坯中物質的逐漸分解，代謝產物開始積累，環境條件不斷變化，微生物區系隨發酵時間而改變，原來有的各微生物的數量開始下降，取而代之的是一群高度特異化的微生物——冠突散囊菌，即通過各種微生物類群之間的反復較量，其中最適合在這種環境中生長的微生物種類則最終取得優勢[6-7]。之前有學者對茯磚茶發花優勢微生物的生物學特性進行了分析[8-11]，而與之伴隨生長的其他微生物生物學特性未有報道。本實驗通過對湖南省冬夏兩季生產過程中的茯磚茶進行取樣，分離出27種真菌微生物，在實驗室條件下對其開展生物學特性研究，以期闡明不同季節茯磚茶發花微生物的種類和演替的差異，為進一步研究提供參考。

1材料與方法

1.1菌株來源供試菌株為27株真菌微生物，其中20株為湖南省冬季茯磚茶發花期間分離得到，另外7株為夏季茯磚茶發花期間分離得到。

1.2試驗方法和內容

1.2.1供試菌株的培養和形態觀察取供試的27株真菌，常溫下復蘇24h后，轉接于查氏培養基中，置于25℃恒溫培養箱中培養7d。

1.2.2培養基的制備浸提黑毛茶，其中茶汁浸提條件為：茶水比：1∶30，溫度100℃，時間：30min，供試培養基共6種。M1：茶汁1000mL，瓊脂20.0g。M2：茶汁l000mL，蔗糖20.0g，瓊脂20.0g。M3：茶汁1000mL，蔗糖20.0g，瓊脂20.0g，馬鈴薯200.0g。M4：PSA培養基：蔗糖20.0g，瓊脂20.0g，馬鈴薯200.0g，蒸餾水1000mL。M5：查氏瓊脂培養基：硝酸鈉3.0g，磷酸氫二鉀(K2HPO4)1.0g，氯化鉀0.5g，硫酸鎂(MgSO4•7H2O)0.5g，硫酸亞鐵(FeSO4)0.01g，蔗糖30.00g，瓊脂20.0g，蒸餾水1000mL。M6：水瓊脂培養基：瓊脂20.0g，蒸餾水1000mL，分別于121℃滅菌20min備用。

1.2.3供試菌株在不同培養條件下生長狀況研究（1）培養基：將27株供試菌株分別接種在M1、M2、M3、M4、M5、M6上，置于28℃培養箱中，培養3d，然后測定菌落直徑并觀察菌落形態，每個處理設3次重復。（2）碳源：以查氏培養基為基本培養基，其中蔗糖分別替換成葡萄糖（C1）、蔗糖（C2）、麥芽糖（C3）、淀粉（C4），置于28℃培養箱中，金花菌培養7d，其余菌培養4d，每個處理設3次重復。（3）氮源：以查氏培養基為基本培養基，其中硝酸鈉分別替換成KNO3（N1）、(NH4)2SO4（N2）、蛋白胨（N3）、牛肉膏（N4）、酵母膏（N5），置于28℃培養箱中，金花菌培養7d，其余菌培養4d，每個處理設3次重復。（4）溫度：將27株供試菌株分別接種在準備好的PSA固體培養基中，分別置于20℃（T1）、25℃（T2）、28℃（T3）、30℃（T4）、35℃（T5）的條件下，培養3d，每個處理設3次重復。1.3試驗數據測量與分析以上每個試驗在每天的同一時間測量菌落直徑。上述所有試驗數據用Excel及SPSS19.0統計軟件進行分析，用t檢驗及方差分析，檢驗各處理間的差異顯著性。

2結果與分析

2.1供試菌株的三點菌落圖冬季共分離鑒定出20株真菌，其中5株曲霉（Aspergillus）（圖1中1~5），1株冠突散囊菌（Eurotiumcristatum）（圖1中的6），7株青霉（Penicillium）（圖1中7~13），2株芽枝霉（Phycomycetes）（圖1中14~15），1株鐮刀菌（Fusarium）（圖1中16），1株木霉（Trichodermaspp.）（圖1中17），2株毛霉（Mucor）（圖1中18、19），1株酵母菌（Yeast）（圖1中20）；夏季共分離鑒定出7株真菌，其中4株金花菌（圖1中21~24），3株曲霉（圖1中25~27）。27株真菌轉接在查氏培養基中，25℃培養7d，菌落形態見圖1。

2.2不同培養基對發花微生物生長的影響發花微生物在不同的培養基中，其菌絲生長速度和產孢數量顯著不同。總體來看，發花微生物在M3和M4中生長較好，在M1和M2中次之，在M5中生長較慢，M6中最差，但不同發花微生物個體之間又存在一定的區別。從圖2及冬季茯磚茶發花微生物在培養基中的菌落形態可知：（1）2株黑曲霉（圖2中1~2），在M1、M2、M3、M4均能生長，且營養成分越充足時黑曲霉菌絲生長速度越快，產孢量也越多，但在M6中完全未生長，表明黑曲霉對營養成分要求較高。其他3株曲霉，在M6中有少量菌絲生長，表明這3株曲霉對營養要求不高，在其他培養基中具有與黑曲霉相似的生長規律。相比黑曲霉，冠突散囊菌（圖2中6）生長速度較慢，且在M6中也是完全未生長，表明冠突散囊菌對營養成分要求較高；從冠突散囊菌在M1、M2與M5中生長情況對比發現，在M2中生長更好一些，表明茶汁營養成分豐富且比例協調，更有利于冠突散囊菌的生長；此外，在先前的研究中發現，茯磚茶在發花的第3天，茶磚內部有少量金花菌斑形成；而該菌接種在茶汁培養基中，置于28℃培養箱中，培養3d，可發現菌落稍顯淡黃色，表明此菌生長速度較慢。（2）青霉（圖2中7~13），從茯磚茶中分離到的7株青霉，對營養成分要求不高，茯磚茶坯可以滿足其生長需要。（3）芽枝霉（圖2中14~15），在M6中均能生長，尤其是芽枝霉2（圖2中15），已有少量孢子產生，表明此菌對營養成分要求極低，在其他培養基中具有與黑曲霉相似的生長規律；試驗發現在冬季茯磚茶發花中，最先分離到的就是芽枝霉2，推測與此菌的生物學特性有一定關聯。（4）鐮刀菌（圖2中16），在M1中生長速度較快，表明茶汁中的營養成分已經可以滿足其生長需要，在茯磚茶發花中占據生長優勢。（5）木霉（圖2中17），在M1中僅有少量菌絲生長，并無孢子產生，在M2、M3、M4、M5中生長相對較好，在M6中生長較差，表明此菌對營養成分要求較高。（6）毛霉（圖2中18~19），在M1和M6中，生長相對較差，不具有生長優勢，可以在茯磚茶坯中生長。（7）酵母菌（圖2中20），可以在M6中生長，同時對比在M1和M5中的生長情況，表明茶汁中含有該菌生長所需的營養物質。從圖2及夏季茯磚茶發花微生物在培養基中的菌落形態可知：（1）4株金花菌，在M6中幾乎都不能生長，表明它們對營養成分要求相對較高；與第2、3株（圖2中22、23）相比，第1、4株金花菌（圖2中21、24）可以在M1中生長，對營養成分要求稍低，試驗中也發現在夏季分離的微生物中，第1、4株金花菌數目相對較多，表明金花菌種族之間存在一定差異，但4株金花菌均可以在茯磚茶坯中生長。（2）3株曲霉，局限曲霉（圖2中25），在M5和M6中幾乎不能生長，表明它對營養要求較高，不具生長優勢；煙曲霉（圖2中26），在M1、M3、M4中生長情況對比發現，在M4中生長最好，但在M3中生長相對較差，推測茶汁中可能含有抑制或不適宜此菌生長的物質，同時在試驗中發現此菌在夏季發花茶樣中的數目較少；黑曲霉（圖2中27），與冬季分離到的黑曲霉具有相似的生長特征。

2.3不同碳、氮源對發花微生物生長的影響冬季茯磚茶發花微生物在培養基中的菌落形態（圖3、圖4）：（1）2株黑曲霉（圖3中1~2），在C1中菌落直徑最大，C3中次之，C2中最小；產孢數目對比，C1中最多，C2中次之，C3中最少；在C4中均未生長，表明單糖既利于菌絲生長又利于產孢，幾乎不能利用多糖，對營養成分要求較高。在無機氮源的培養基中菌落直徑明顯小于有機氮源的培養基中，表明有機氮源更有利于黑曲霉的生長。其他3株曲霉，具有與黑曲霉相似的生長規律，但又有一定的差別，如：在C4中菌絲生長速度較快，且產生了孢子，表明這3株曲霉可以利用多糖。曲霉4（圖4中的菌落4），在無機氮源的培養基中生長情況相似，在N5中產生的孢子數多些，而曲霉5（圖4中5）是在N3中孢子數多些，表明不同微生物對氮源的選擇不盡相同。冠突散囊菌（圖3中6），具有與黑曲霉類似的生長規律，單糖有利于其菌絲生長，對多糖的利用率較差。有機氮源可以更好地促進冠突散囊菌的生長，但同時研究發現，冠突散囊菌在N3、N4中菌落直徑大于在N5中，但在N5中卻產生了大量黑色素，表明N3、N4可以促進冠突散囊菌菌絲的生長，N5可以促進孢子的成熟并分泌色素。（2）青霉，除了青霉1（圖3中7）不能在C4中生長外，其他6株青霉均能生長，青霉3（圖3中9）較為特殊，在C1和C4中生長情況相似，表明大部分的青霉可以利用多糖。無機氮源對青霉的生長促進不及有機氮源，且無機氮源中以硝態氮的促進作用較強，有機氮源有一定區別；青霉1（圖4中7），酵母膏對其生長促進作用較強；青霉2~4（圖4中8~10），蛋白胨對其生長促進作用較強；青霉5~7（圖4中11~13），蛋白胨和酵母膏的促進作用相似，但牛肉膏的促進作用不如蛋白胨和酵母膏。（3）芽枝霉，在C1、C2、C3中均能正常生長，在C1和C2中生長幾乎無差別，在C4中生長速度較慢，但可以產孢，表明芽枝霉利用多糖的能力較強。芽枝霉1（圖4中14），在N2中菌絲生長速度快于以N1中，表明銨態氮源比硝態氮源更有利于該菌菌絲生長，在有機氮源的生長情況對比發現，N5促進作用最強，N3次之，N4最差；芽枝霉2（圖4中15），在無機氮源培養基中菌絲生長速度相似，但在N1中產生了孢子，表明硝態氮源利于此株菌產孢，在有機氮源培養基中對比發現，酵母膏對其促進作用最強。（4）鐮刀菌，在C1和C2中生長速度較快，差別不大，在C3中生長速度稍慢，在C4中生長明顯受到抑制，生長速度最慢。無機氮源中，硝態氮源明顯比銨態氮源的促進作用較強，菌落大，菌絲生長速度快；有機氮源中以酵母膏的促進作用最強，牛肉膏次之，蛋白胨最差。（5）木霉，在4種碳源的培養基上生長速度為：C1>C2>C4>C3，在C2和C4中生長情況相似，表明對多糖的利用能力強。無機氮源對菌絲生長速度和產孢促進方面明顯不及有機氮源，無機氮源中，硝態氮源的促進作用低于銨態氮源，有機氮源中牛肉膏最差，蛋白胨次之，酵母膏最強。（6）毛霉1~2（圖3中18~19），在C1和C2中生長正常，在C3中生長開始受到抑制，毛霉1在C4中幾乎不能生長，但毛霉2在C4中形成了一定菌斑，盡管菌落直徑較小，表明毛霉2具有一定的多糖利用能力。2株毛霉對無機氮源的利用情況有一定差別，毛霉1，硝態氮源的促進作用不及銨態氮源；毛霉2，與毛霉1正好相反。有機氮源中，2株毛霉相似，牛肉膏最差，蛋白胨次之，酵母膏的促進作用最強。（7）酵母菌，在C1、C2、C3中生長較為相似，在C4中完全不能生長，表明此菌對碳源有一定的要求。有機氮源的促進作用強于無機氮源，有機氮源中，蛋白胨最差，牛肉膏次之，酵母膏最強；無機氮源中，硝態氮源不及銨態氮源。夏季茯磚茶發花微生物在培養基中的菌落形態（圖3、圖4）：（1）金花菌，在C1中生長最好，在C4中除第1、3株金花菌（圖3中21~23）可以勉強生長外，第2、4株金花菌（圖3中22~24）均不能生長。4株金花菌，總體看，有機氮源的促進作用強于無機氮源；有機氮源方面，大體相似，蛋白胨和牛肉膏的促進作用不及酵母膏。無機氮源方面，第1、3株金花菌類似，銨態氮源的促進作用強于硝態氮源；第2、4株金花菌相似，硝態氮源的促進作用強于銨態氮源。（2）3株曲霉，局限曲霉（圖3中25），在C1、C2、C3中可以緩慢生長，在C4中不能生長；無機氮源促進作用相似，有機氮源中酵母膏的促進作用相對較強。煙曲霉（圖3中26），在C1、C2中生長較快，差別不大，在C3中生長略慢，在C4中也可以生長，生長速度更為慢些；硝態氮源的促進作用不及銨態氮源，有機氮源的促進作用與局限曲霉相似。黑曲霉（圖4中27），與冬季茯磚茶樣品中分離到的黑曲霉具有相似的生長規律。碳、氮源是微生物生存必需的營養物質，總體來看，發花微生物在以葡萄糖和蔗糖為碳源的培養基中生長最好，麥芽糖次之，淀粉較差；相比無機氮源，有機氮源對菌絲生長速度影響明顯，但不同發花微生物之間又有一定區別。

2.4不同溫度對發花微生物生長的影響溫度對微生物的生長影響顯著，大部分發花真菌微生物在低于20℃或超過35℃時，生長會受到抑制，但不同發花微生物其最適生長溫度具有一定的差異性。冬季茯磚茶發花微生物在培養基中的菌落形態（圖5）：（1）2株黑曲霉（圖5中1~2），在試驗的溫度區間內，菌落直徑及產孢數目與溫度成正比。其他3株曲霉，曲霉3（圖5中3）與黑曲霉具有相似的生長規律；曲霉4（圖5中4），在T1~T3，菌落直徑與溫度成正比，從T4以后，生長明顯受到抑制，在T5時停止生長；曲霉5（圖5中5），在T1~T4，菌落直徑與溫度成正比，在T5時，生長受到了抑制。冠突散囊菌（圖5中6），在T1時，未見生長，在T5時，生長受到抑制，在T2~T4，菌落直徑與溫度成正比。（2）青霉，在T3之前，菌落直徑與溫度成正比，T3之后，菌落直徑與溫度成反比。（3）芽枝霉，在T1~T2，菌落直徑與溫度成正比，在T3~T5，菌落直徑與溫度成反比，在T5時停止生長。（4）鐮刀菌，在T1~T4，菌落直徑與溫度成正比，氣生菌絲也愈發致密，在T5時，生長受到抑制。（5）木霉，在T1~T4，菌落直徑與溫度成正比，在T5時，生長受到抑制。（6）毛霉1（圖5中18），在T1~T4，菌落直徑與溫度成正比，在T5時，生長受到抑制；毛霉2（圖5中19），在T3之前，菌落直徑與溫度成正比，在T4之后，生長受到抑制，T5時，抑制作用明顯。（7）酵母菌，在T4之前，菌落直徑與溫度成正比，T5時，生長受到一定抑制，但該菌在T1~T5，均可生長。夏季茯磚茶發花微生物在培養基中的菌落形態（圖5）：（1）4株金花菌，在T1~T4，菌落直徑與溫度成正比，T5時生長受到抑制，但4株金花菌最適生長溫度又不盡相同。在T1時，4株金花菌都未見生長；T2時，第1株（圖5中21）、4株（圖5中24）開始生長，且已產生了閉囊殼，第2株（圖5中22）、3株（圖5中23）僅有少量菌絲產生；T3~T4，菌落直徑與溫度成正比，且閉囊殼數目逐漸增多，T5時，第2株金花菌的生長受到的抑制作用明顯強于其他3株。（2）3株曲霉，其中局限曲霉，在T4以后，生長開始受到抑制，其他2株曲霉，在試驗的溫度區間內，菌落直徑與溫度始終成正比。

3討論

茯磚茶的發花工藝其實質是培育有益菌——冠突散囊菌的生長繁殖，通過空氣中的微生物自然接種，經過反復較量，冠突散囊菌最終占據優勢，這是一種自然選擇的結果。由于不同季節外界條件差異明顯，發花環境中微生物區系有差異，加之微生物自身的生長特性，因此不同季節茯磚茶發花微生物的種群及演替規律有差異。通過對不同季節茯磚茶發花期間分離的微生物的生物學特性研究發現，不同微生物對其生長物質，如碳氮源，利用能力有區別，表明發花微生物對營養成分的需求不一。從發花微生物的演變上來看，一般最先分離出來的不是冠突散囊菌，而是其他利用多糖能力較強的微生物，通過其創造一定條件，有利于冠突散囊菌繁殖發育，最終占據優勢，表明在茯磚茶發花中微生物的演變與它們的生物學特性有較大的關聯。外界溫度對發花微生物的生長也具有重要影響，一般真菌微生物能在20~35℃之間生長，但不同微生物對溫度的敏感程度不盡相同。冬季烘房溫度偏低，在24~28℃之間，而夏季烘房溫度偏高，在30~35℃之間。因此，冬夏兩季分離出的微生物從種類和長勢上差異較大。生產中，為滿足發花微生物的生長與發育，在茶坯壓制前添加熬制老茶梗汁液或者一定比例的蔗糖，有利于茯磚茶的發花，有利于提高“金花”的數量和大小。過去有研究[14]認為，茯磚茶發花中，除冠突散囊菌外，其他霉菌等是污染微生物，或為“雜菌”，應在生產中加以控制。上述研究發現，茯磚茶坯發花時最先生長的微生物并非是冠突散囊菌。如冬季發花的茯磚茶，最先生長的是芽枝霉，然后是青霉和冠突散囊菌等這些微生物逐漸生長，通過不斷的較量，最終冠突散囊菌成為優勢微生物，在此期間，發生了復雜的變化。這些“雜菌”的存在應具有一定作用。又如木霉等能夠很好地利用多糖，可以降解茶葉中的多糖，如纖維素，分解為葡萄糖等單糖，有利于冠突散囊菌的生長發育。實驗表明，冬季發花的茯磚茶“雜菌”較多，最終冠突散囊菌的數目也較多；夏季發花的茯磚茶“雜菌”較少，最終茯磚茶成品中冠突散囊菌的數目也較少，這是值得進一步研究的問題。發花工藝是茯磚茶品質形成的關鍵步驟，在目前的茯磚茶生產中，主要是通過人工控制一定的環境條件，促使優勢微生物生長繁殖，但受外界環境影響較大，茯磚茶質量不穩定。

通過對不同季節茯磚茶發花期間微生物種類、演替規律及生物學特性，并結合生產過程中茯磚茶發花控制條件的研究，一方面從理論上解釋了不同季節茯磚茶發花微生物種類的差異性，另外為進一步開發茯磚茶現代化的精準誘導調控發花工藝奠定了基礎。

作者：趙仁亮 譚吉慧 盧秦華 吳丹 朱旗 單位：湖南農業大學茶學教育部重點實驗室 國家植物功能成分利用工程技術研究中心