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《輻射防護通訊雜志》2016年第3期

摘要：

介紹了端粒長度主要檢測方法TRF、Q-FISH、FlowFISH、Q-PCR、STELA的基本原理及其優缺點，端粒檢測在輻射損傷研究及輻射流行病學調查和臨床研究中的應用，以及本實驗室改進后的Q-PCR方法及其應用。

關鍵詞：

端粒;長度變異;檢測;輻射損傷

端粒是位于真核細胞線狀染色體末端的一段DNA蛋白質復合體。它與端粒結合蛋白一起構成了特殊的“帽子”結構，其作用是維持染色體的完整性，防止染色體末端被DNA損傷修復系統意外識別為DNA雙鏈斷裂［1］。端粒長度能夠反映端粒保持和消蝕狀態以及細胞的復制潛能，長度變異是研究端粒輻射損傷的一個重要指標。本文介紹端粒長度的主要檢測方法及其在輻射損傷研究中的應用，以期為端粒輻射生物學研究提供新的方法學借鑒。

1端粒長度檢測方法

端粒長度的主要檢測方法包括:端粒限制性片段(TRF)、定量熒光原位雜交(Q-FISH)、流式熒光原位雜交(FlowFISH)、定量聚合酶鏈式反應(Q-PCR)、單個端粒長度分析(STELA)。

1．1方法

1．1．1TRF［2］

TRF方法是通過索瑟恩印跡法來評估細胞群的平均端粒長度。多年來，它是端粒研究領域的唯一定量的方法，是其它方法的參考，被視為金標準。TRF方法的基本檢測原理是將待檢樣本的基因組DNA用限制性內切酶消化，通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，并按其在凝膠中的位置轉移至硝酸纖維素膜上，固定后與熒光標記的端粒DNA特異探針進行雜交，將游離探針洗滌后檢測熒光信號。根據端粒DNA條帶熒光信號強弱，可獲得待檢樣本的平均端粒長度。并且由于不同的限制性核酸內切酶作用位點不同，獲得的端粒長度也不同。TRF由于所用的限制性核酸內切酶、起始DNA的數量和質量，以及斑點分析技術方面的差異，可能導致TRF多次測出的端粒長度數據不易橫向比較。

1．1．2Q-FISH［2］

Q-FISH方法的檢測原理是利用對DNA寡聚核苷酸具有選擇性高親和力的熒光標記(CCCTAA)3肽核苷酸(PNA)探針與中期染色體端粒DNA序列進行雜交，通過激光共聚焦顯微鏡獲得中期染色體及其端粒的熒光圖像，檢測一個中期相中所有端粒的總熒光強度，并與參考細胞的染色體中期相的總熒光強度進行比較，獲得相對端粒平均長度(包括純端粒區和部分可變區)。每個樣本需要分析15～20個中期相。Q-FISH方法也可用于檢測＜0．5kb的端粒序列以及染色體融合，但是不適于檢測有絲分裂指數非常低的細胞類型。

1．1．3FlowFISH［2］

與Q-FISH相似，FlowFISH方法的檢測原理是用熒光標記PNA探針與細胞在混懸液中雜交，洗滌掉游離的探針后，雜交產物的熒光信號被流式細胞儀測量，可獲得細胞群所占比例及其相對端粒長度。FlowFISH能夠測量同一樣本內不同細胞亞群的端粒長度，包括純端粒序列和部分可變區序列。FlowFISH方法僅限于使用新鮮的血液樣本。自動化的多色FlowFISH是當前最快速和最敏感地測量人血各類白細胞平均端粒長度的方法。利用FlowFISH測量弱于細胞免疫表型的熒光信號，需要對方法進行必要的校準和控制，這一過程相對費時。

1．1．4Q-PCR［2］

Q-PCR方法費時短，成本低，具有快速和高通量的特點，可檢測細胞群平均端粒長度，包括純端粒序列和部分可變區序列。Q-PCR的檢測原理是對用端粒(T)引物擴增的端粒產物的熒光信號與用單拷貝基因(S)引物擴增的單拷貝基因產物進行比較，用含等量樣本的兩個反應管同時擴增T和S，檢測產物熒光信號，利用特定分析軟件可獲得相對端粒長度。Aviv1等［3］采用TRF和Q-PCR方法測量的白細胞端粒長度，TRF檢測的端粒平均長度為Y，Q-PCR檢測同一樣本端粒的平均長度為X，對二者結果進行比較分析，建立的回歸方程為Y=2．16X+4．02，二者間相關顯著(相關系數為0．847)。TRF方法的批間誤差約為2%，Q-PCR為6%。Q-PCR方法的缺點是樣本內和樣本間的變異性相對較高。1．1．5STELA［2］STELA方法的檢測原理是通過單分子PCR檢測特定染色體的端粒長度，包括純端粒序列和可變區序列，由于引物位點是已知的，亞端粒區長度可被扣除。STELA能夠對有限的樣本量進行高度精確的單個端粒長度測量，適用于少見細胞亞群和非分裂的衰老細胞的端粒縮短分析和融合作用分析。但是由于STELA方法的技術難度大、勞動強度高以及低通量，使其不能大規模臨床應用。

1．2小結

圖1給出了各種方法的檢測區域［2］。表1匯總了各種方法的主要特點［4］。

2端粒檢測在輻射損傷研究中的應用

2．1實驗研究

端粒長度影響細胞的輻射敏感性。人喉鱗癌細胞株、人乳腺癌細胞株、輻射抗性細胞株等不同癌細胞株的端粒長度與其輻射敏感性呈負相關［5］。Berardinelli等［6］采用X射線4Gy量照射TK6淋巴母細胞，檢測結果表明，受照TK6淋巴母細胞初始克隆的端粒長度顯著大于未受照射細胞;15個獨立的TK6克隆中，4個克隆有長端粒，4個克隆有短端粒，短端粒克隆細胞更具輻射敏感性。Drissi等［7］對正常人成纖維細胞端粒的研究結果顯示，短端粒細胞具有更高的輻射敏感性，并且傳代延遲。端粒變異包括染色體斷裂、端粒嵌入、端粒俘獲及染色體重排等。Slijepcevic等［8］采用γ射線1．0Gy照射倉鼠細胞株CHE和CHOK1、小鼠細胞株SCIDST和CB17，結果表明，CHE、CHOK1、SCIDST和CB17細胞株間隙端粒位點斷裂分別為8．6%、11．8%、1．7%和0%;端粒俘獲分別為2．3%、0．5%、4．7%和0%;染色單體斷裂處端粒嵌入分別為7．3%、8．7%、10．6%和10．6%。哺乳動物細胞中DNA雙鏈斷裂(DSB)修復的主要途徑是典型的非同源末端融合。Muraki等［9］研究端粒損失機制及其對染色體不穩定性的后果，結果發現，端粒附近不能進行非同源末端融合，造成該位點DSB修復缺陷，使得端粒附近DSB更易于形成染色體重排。由于人類端粒是高度非均一性的，端粒損失誘發可遺傳的染色體重排通常涉及遺傳疾病。這是電離輻射誘導正常細胞衰老的重要機制之一［10］。端粒酶活化是保持端粒長度的主要途徑。鄒躍等［11］研究發現，X射線(1～5Gy，1．48Gy/min)能誘導人A549細胞株端粒酶活性表達;端粒長度分別與照射劑量和照射后時間依賴性增強和延長;照射劑量越高，端粒延長出現越早。郭月鳳等［12，13］研究表明，60Coγ射線(0．2～6．0Gy，0．96Gy/min)和12C6+離子(0．1～2．0Gy，0．3～0．5Gy/min，165MeV)均可導致培養人淋巴細胞端粒增加;56Fe17+離子照射(0．1～1．0Gy，0．1～0．4Gy/min，165MeV)可誘發人淋巴細胞平均端粒長度在照后12h隨吸收劑量增加而減小，在照后24～72h恢復至正常或接近正常水平。低LET輻射(γ射線、X射線)、12C6+離子輻射誘發培養人淋巴細胞平均端粒長度增加，與文獻［8］結果一致，其機制可能是誘發了染色單體斷裂并在修復過程中發生了端粒俘獲和嵌入。56Fe17+離子輻射誘發培養人淋巴細胞平均端粒長度縮短，其機制可能是誘發了涉及端粒位點及附近DNA雙鏈斷裂的染色體斷裂及端粒DNA斷片丟失。結果可見，對于某一種細胞，在一定的劑量范圍內輻射誘發的端粒長度變化主要取決于射線種類和性質。

2．2流行病學調查和臨床研究

Lin等［14］調研結果表明，人外周血淋巴細胞中，B細胞的端粒酶活性最高且端粒最長，衰老的CD8+CD28－T細胞的端粒酶活性最低、端粒最短，CD8+CD28－T細胞比例升高與淋巴細胞的平均端粒長度縮短顯著相關。說明端粒酶活性是維持淋巴細胞端粒長度的必要條件。Das等［15，16］研究高水平天然輻射地區印度西南部喀拉拉海岸新生兒和健康成人的端粒長度。將新生兒和成年人分別按年吸收劑量分為＜1．50mGy/年(正常水平天然輻射組)和1．51～3．00mGy/年、3．01～5．00mGy/年、＞5．00mGy/年。結果表明，新生兒4個吸收劑量組的平均相對端粒長度分別為1．10±0．03、0．98±0．01、1．05±0．02和1．07±0．03;成年人4個吸收劑量組的平均相對端粒長度分別為1．22±0．15、1．12±0．15、1．08±0．08、1．12±0．11。高水平天然輻射地區新生兒/成年人各組平均相對端粒長度和正常水平天然輻射地區無顯著差異。說明高本底地區天然輻射對新生兒和成年人端粒長度無顯著影響。職業照射引起端粒長度變化可能受到射線種類和性質的影響。Ilyenko等［17］用FlowFISH和Annexin-V試驗法分別檢測了83名切爾諾貝利核事故凈化工人、在掩蔽物體內工作的建筑工人和健康對照人員的外周血淋巴細胞端粒長度和凋亡率。結果發現，與健康對照人員相比，切爾諾貝利凈化工人相對端粒長度顯著減少，而在掩蔽物體內從事建筑工作的暴露量在職業限值以下的放射性工作人員則有降低的趨勢。在劑量大于職業限值時，凋亡早期的淋巴細胞數目和端粒長度呈負相關。研究結果顯示，受到低劑量輻射端粒縮短，且這一變化可能保持超過20年。來自拉脫維亞的切爾諾貝利核事故凈化工人中與年齡相關的退行性疾病和癌癥發病率升高，且心血管疾病的死亡率升高。Reste等［18］采用Q-PCR方法測量了595例凈化工人及236例健康對照人員外周血淋巴細胞相對端粒長度，研究遷延輻照對切爾諾貝利凈化工人淋巴細胞端粒長度的遠期效應。結果顯示，切爾諾貝利凈化工人的相對端粒長度比對照人員顯著增加;從事挖掘、滅活等“較臟”工作的工人以及患有癌癥的工人，其端粒長度顯著大于對照人員。而那些患有白內障、動脈硬化、骨質疏松和冠心病的工人則顯示端粒縮短。這兩項研究，不同的工人在凈化工作中受到輻射的類型、劑量是不同的，可能是導致凈化工作中的職業照射所致淋巴細胞端粒長度變異的不同，同時也可能受到原有疾病種類的影響。Sabatino等［19］研究發現縮短的淋巴細胞端粒可以預測心血管疾病和死亡率，并且端粒在電離輻射誘發的染色體和染色單體畸變中有重要作用。結果提示，職業電離輻射導致的端粒消蝕可能引起血管老化進而導致心血管疾病。M＇kacher等［20］研究證明，放療后端粒顯著縮短的患者后來發展成了心血管疾病。提示外周血淋巴細胞端粒縮短與心血管相關的發病率和死亡率有關聯。端粒長度可作為一個幫助確定患者放療后發生冠心病高風險的獨立預后因素，對于放療與誘發的冠心病的早期檢測和預防具有重要意義。

3本實驗室對Q-PCR方法的改進及應用

通過比較和分析TRF、Q-FISH、FlowFISH、Q-PCR、STELA檢測方法，結果認為，Q-PCR方法操作簡單、快速、靈敏、高通量、高度可重復性、樣本DNA可保存且需求量少，但是，只能獲得相對端粒長度，并且樣本內和樣本間的變異性相對較高，無法對不同時間和不同實驗室的端粒長度檢測結果進行比較。本實驗室將端粒標準DNA的使用與Q-PCR技術結合起來，建立了可用于細胞群絕對端粒長度測量的絕對Q-PCR方法，并用于γ射線輻射對人淋巴細胞端粒長度影響研究［11］。與Q-PCR方法相比，本實驗室建立的絕對Q-PCR方法優點如下:①建立了端粒標準DNA的標準曲線，達到了對該方法的校準和控制;②可在不使用TRF方法對Q-PCR的測量結果進行校正的情況下，獲得絕對端粒長度的檢測結果;③該方法使得不同時間和不同實驗室間的檢測結果進行比較成為可能。但是，本實驗室建立的絕對Q-PCR方法的可操作性、精確度和重復性都有待于在今后的研究中得到進一步驗證。

參考文獻：

［5］曹振，周云峰，駱志國，等．不同癌細胞株放射敏感性與端粒長度的關系［J］．武漢大學學報(醫學版)，2005，26(4):470．

［11］鄒躍，周湘艷，杜雛霞，等．電離輻射誘導端粒延長作用的研究［J］．中華放射醫學與防護雜志，2005，25(6):254．

［12］郭月鳳，張睿鳳，張慧芳．γ射線輻射對人淋巴細胞端粒長度影響研究［J］．中國職業醫學，2015，42(4):421．

［13］張睿鳳，郭月鳳，黨旭紅，等．12C離子輻射對人淋巴細胞端粒長度的影響［J］．輻射防護通訊，2014，34(4):29．

作者:郭月鳳 張睿鳳 單位:中國輻射防護研究院