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作者：郭曉蘭，袁國華，周京國，唐中，劉寧濤，楊明輝，青玉鳳，吳鳳霞，朱道銀

【摘要】目的：構建端粒保護蛋白TPP1短發夾RNA表達載體，探討抑制TPP1表達后對端粒DNA損傷及細胞增殖的影響.方法：體外構建端粒保護蛋白tpp1shRNA逆轉錄病毒表達載體shTPP101，shTPP102，與表達外源性TPP1的TPP1HA質粒共同轉染293T細胞，WesternBlot檢測shTPP1抑制外源性TPP1蛋白表達；RTPCR檢測shTPP1抑制小鼠胚胎成纖維細胞（mouseembryonicfibroblast,MEF）內源性TPP1mRNA的表達.再用shTPP1分別感染ATM＋/＋MEF和ATM－/－MEF細胞后，分別采用細胞生長曲線和BrdU摻入法檢測細胞增殖，免疫熒光/端粒肽核酸熒光原位雜交法（IF/PNAFISH）檢測端粒功能障礙誘導損傷灶（TIF）的形成.結果:shTPP101和shTPP102均能明顯抑制外源性TPP1蛋白和內源性TPP1mRNA的表達，shTPP101和shTPP102作用于原代培養的MEFs后細胞生長緩慢，BrdU陽性細胞數量分別占8.0%和8.7%，顯著低于對照細胞的29.3%(P<0.01,P<0.01)；而細胞表現為體積變大，形態扁平等類似細胞衰老的形態學改變；IF/PNAFISH法檢測結果顯示，shTPP1作用于atm＋/＋MEF細胞后導致端粒DNA損傷標志物-磷酸化的H2AX（γH2AX）和53BP1損傷灶（TIF）的形成，定量結果顯示約50%的ATM+/+細胞中出現至少5個TIF；而在shTPP1作用后的ATM-/-細胞中，端粒γH2AX和53BP1形成的TIF數量顯著減少，出現5個TIF的細胞數量不足5%，與對照組細胞相比無顯著性差異.結論：抑制TPP1表達后誘發端粒ATM依賴的dna損傷反應，進而抑制細胞增殖，促進細胞衰老.

【關鍵詞】端粒;短發夾RNA;DNA;損傷反應

0引言

端粒位于真核細胞染色體的末端，由串聯重復的DNA和端粒結合蛋白組成，其主要功能是保持染色體的完整性，同時也是細胞生存期限的關鍵調控因子［1］.對腫瘤的研究發現，大多數腫瘤細胞在分裂增殖過程中保持穩定的端粒長度，因而通過干涉端粒的結構和功能有可能控制腫瘤發展［2］.目前發現端粒保護蛋白主要有6個亞單位：TRF1，TRF2，TIN2，Rap1，POT1和TPP1，他們共同組成端粒保護蛋白復合體（Shelterin）［3］，其中TPP1是形成蛋白復合體的關鍵因子之一［4-5］.我們通過采用靶向端粒結合蛋白TPP1小片段干擾RNA（siRNA）技術，構建TPP1短發夾RNA（shRNA）逆轉錄病毒介導的表達載體，觀察抑制TPP1表達后所誘導的端粒DNA損傷反應以及對細胞增殖和衰老的影響.

1材料和方法

1.1材料構建TPP1的shRNA寡核苷酸和PCR引物由美國Sigma公司合成；RNA提取試劑盒、RTPCR反應試劑盒、轉染試劑lipofectamine（Invitrogen公司）；限制性內切酶BglⅡ,EcoRⅠ,HindⅢ（Biolabs公司）；γH2AX鼠mAb（美國Upstate公司）；凝膠成像系統（美國AlphaInnotech公司）；PCR擴增儀PTC200EngineCycler（美國MJResearch公司）；BX41型顯微鏡（日本Olympus公司）.

1.2方法

1.2.1TPP1shRNA表達載體的構建小鼠TPP1的mRNA序列來自GenBank(GI:22823923)，參照siRNA靶點設計原則，設計如表1.合成的正義鏈和反義鏈經變性和退火反應后形成雙鏈DNA，用限制性內切酶BglⅡ和HindⅢ將其定向克隆至逆轉錄病毒載體RetropSuper（含有嘌呤霉素抗性篩選標記），經EcoRⅠ和HindⅢ酶切鑒定得到的陽性克隆RetropSupershTPP1，簡稱shTPP1.表1shTPP101和shTPP102的堿基序列

1.2.2細胞培養和轉染將質粒shTPP101和shTPP102分別轉染病毒包裝細胞293T，轉染操作按lipofectaminePlus說明進行：①接種1×105個293T細胞于10cm細胞培養盤中，37℃，50mL/LCO2培養過夜；②更換為無血清DMEM，逐滴加入轉染試劑Lipofectamine（含4μgshTPP1質粒DNA），培養4～6h后，更換為完全DMEM培養基培養；③分別于培養24，48h后收集293T細胞培養上清感染MEF細胞，72h后加入2mg/L嘌呤霉素進行篩選.

1.2.3WesternBlot檢測shTPP1抑制外源性TPP1表達細胞轉染72h后收集293T細胞，超聲破碎細胞后，4℃,10000g離心20min，收集上清進行蛋白質定量測定.取50μg蛋白質經SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后電轉移至PVDF膜，以抗HA抗體檢測TPP1HA的表達水平.

1.2.4RTPCR檢測shTPP1抑制MEF內源性TPP1mRNA的表達收集含有逆轉錄病毒的293T細胞培養上清，以MOI=500的病毒滴度感染MEF細胞，48h后重復感染1次，72h后收集細胞提取總RNA，采用RTPCR檢測shTPP101和shTPP102對MEF細胞內源性TPP1在轉錄水平表達的干擾作用.TPP1上游引物序列：5′ATGTCCGATTCAGGGTTGCTGG3′，下游引物序列：5′TCATACCTGGGTTAACTCAGACTCTG3′.同時擴增GADPH作為內參.GADPH上游引物序列：5′TCACCACCATGGAGAAGGC3′,下游引物序列：5′GCTAAGCAGTTGGTGGTGCA3′.PCR反應條件：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃30s，共25個循環.

;1.2.5細胞生長曲線和BrdU摻入實驗MEF細胞經含有shTPP101和shTPP102表達質粒的逆轉錄病毒感染后，加入2mg/L嘌呤霉素篩選2wk獲得穩定表達shTPP101或shTPP102的細胞.然后按5×104/孔接種于細胞培養6孔板中，分別于第0，2，4，6，8日作細胞計數，繪制細胞數量-時間的生長曲線.同時按2×104/孔的細胞接種8孔的chamberslide，培養過夜后加入BrdU（終濃度為10μmol/L），繼續培養1h，固定細胞后以抗BrdU抗體檢測摻入BrdU后的細胞及其數量.

1.2.6免疫熒光/端粒肽核酸熒光原位雜交法（IF/PNAFISH）檢測端粒功能障礙誘導的損傷灶（TIF）將逆轉錄病毒介導的shTPP1分別感染ATM+/+MEF和ATM-/-MEF細胞，2mg/L嘌呤霉素篩選2wk.按2×104/孔接種chamberslide培養過夜，按文獻［6］行IF/PNAFISH法檢測端粒上磷酸化的H2AX和53BP1的TIF形成.同時WesternBlot檢測細胞中磷酸化的H2AX（γH2AX）水平.

統計學處理:實驗結果中兩組計量資料之間的比較，采用x±s進行t檢驗.

2結果

2.1逆轉錄病毒介導的shTPP1質粒的鑒定和功能檢測按上述描述的方法構建逆轉錄病毒介導的shTPP1質粒.shTPP1質粒經限制性內切酶EcoRⅠ和HindⅢ酶切后，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示約為300bp的片段，而空載體酶的片段為240bp左右，與預期值一致，即shTPP1的大小為60bp左右（圖1A）.shTPP1與表達外源性的TPP1HA質粒共同轉染293T細胞后，WesternBlot結果顯示shTPP101和shTPP102均能明顯抑制外源性TPP1蛋白的表達（圖1B）.RTPCR結果表明shTPP101和shTPP102分別有效地降低了MEF細胞內源性TPP1在轉錄水平的表達（圖1C）.

A:shTPP1經EcoRⅠ和HindⅢ酶切；B:WesternBlot檢測shTPP1作用后外源性TPP1蛋白的表達水平;C:RTPCR電泳.M:標準分子質量;V:空載體;1:shTPP11;2:shTPP12;Tubulin:加樣的蛋白量；GAPDH:內參.

圖1shTPP1質粒的構建和鑒定及其功能檢測

2.2抑制TPP1表達對細胞增殖的影響與對照組細胞相比，shTPP1作用于原代培養的MEFs后，細胞生長明顯減緩.BrdU細胞增殖摻入實驗進一步證實，BrdU陽性細胞數量在空載體質粒轉染的對照細胞組中占29.3%，在shTPP101或shTPP102作用后的細胞分別僅占8.0%(t=11.49,P<0.01)和8.7%(t=10.96,P<0.01).增殖受到抑制的細胞在顯微鏡下表現為體積變大、形態扁平等類似細胞衰老的形態學改變（圖2）.

2.3抑制TPP1表達對端粒DNA損傷反應的影響shTPP1作用于ATM+/+細胞后，γH2AX明顯增高，而在ATM-/-細胞中則未檢測到(圖3A)；在空載體質粒轉染的ATM+/+細胞中γH2AX形成TIF的陽性率為5%，在shTPP101或shTPP102作用后的ATM+/+細胞則分別為45%(t=15.49,P<0.01)和40%(t=11.26,P<0.01)；53BP1在空載質粒轉染的ATM+/+對照細胞中形成TIF的陽性率為4.0%，而在shTPP101或shTPP102作用后的ATM+/+細胞中TIF分別為42%(t=14.72,P<0.01)和35%(t=9.97,P<0.01)；TPP1受到抑制后，ATM+/+細胞中γH2AX形成TIF的信號（綠色）、53BP1形成TIF的信號（綠色）與端粒PNAFISH雜交的信號TTAGGGFISH（紅色）相重合，表明DNA損傷反應發生在染色體的端粒.定量分析顯示，大約50%的ATM+/+細胞中出現至少5個由γH2AX或53BP1形成的TIF（圖3B，C）；ATM-/-細胞在shTPP1作用后的細胞中形成TIF的數量與空載體轉染細胞相比無明顯差異，ATM-/-細胞中出現5個TIF的細胞數量不足5%（圖3D），表明抑制TPP1表達后誘導端粒發生了ATM依賴的的DNA損傷反應.

3討論

端粒除保持染色體的完整性外，在調控細胞的增殖能力方面起著關鍵性作用.哺乳動物細胞通過端粒上特有的蛋白區分正常染色體末端不被識別為損傷的DNA而誘發ATM（ataxiatelangiectasiamutated）或ATR（ataxiatelangiectasiaandRad3related）介導的DNA損傷反應［7］，出現DNA損傷蛋白53BP1和γH2AX在端粒的聚積，導致細胞增殖衰竭或凋亡［8］.端粒功能障礙引起的細胞增殖衰竭和凋亡是機體清除衰老細胞的一個重要途徑，也是機體構成的一道重要癌變防御屏障.大多數腫瘤細胞在分裂增殖過程中保持穩定的端粒長度，因而在腫瘤細胞中誘導端粒功能障礙有可能成為新的治療策略.

A:WesternBlot檢測ATM+/+和ATM-/-細胞中的γH2AX；B:IF/PNAFISH顯示ATM+/+和ATM-/-細胞端粒中γH2AX形成的TIF；C:IF/PNAFISH顯示ATM+/+和ATM-/-細胞端粒中53BP1形成的TIF；D:定量分析γH2AX和53BP1在ATM+/+和ATM-/-細胞端粒中TIF的形成.V:空載體;1:shTPP11;2:shTPP1.

圖3抑制TPP1表達誘發細胞端粒ATM依賴的DNA損傷反應

端粒保護蛋白在調控端粒的結構和功能方面起著關鍵性作用.最近OConnor等［9］發現，TPP1表達的缺失可以導致端粒保護蛋白復合體的形成障礙，Chen等［10］則發現TPP1具有調控胞核輸出通路信號作用，直接調節其他端粒保護蛋白亞單位在核內水平.鑒于TPP1在端粒保護蛋白復合體中的重要功能，我們設

想是否可以通過抑制TPP1表達而誘導端粒功能障礙、抑制細胞增殖，為此我們構建了針對TPP1的siRNA表達載體（shTPP1），并觀察其對端粒DNA損傷反應的影響.

MEF細胞經shTPP1作用后，內源性TPP1mRNA表達受到完全抑制，伴隨細胞生長明顯遲緩，BrdU攝入細胞的陽性率較空載質粒轉染的細胞減少3倍左右；同時shTPP1作用后細胞出現體積變大，形態扁平等細胞衰老的形態學表現.結果說明經shTPP1抑制內源性TPP1表達后可以抑制細胞增殖，導致細胞衰老.

真核細胞的端粒DNA隱藏于保護蛋白復合體之中，從而避免被細胞自身的DNA損傷檢控機制識別為DNA雙鏈斷裂（doublestrandbreak,DSB）而誘導DNA損傷反應.抑制TPP1表達導致細胞衰老是否可以歸因于DNA損傷反應而引起的端粒功能障礙呢？為此我們對端粒DNA損傷反應進行了檢測，結果顯示，經shTPP1作用抑制TPP1表達后，DNA損傷蛋白H2AX的磷酸化水平明顯增高，TIFs發生率在shTPP1作用后的ATM+/+細胞中達到40%~45%，明顯高于轉染空載質粒的ATM+/+對照細胞的4.0%~5.0%；而且γH2AX和53BP1形成的TIF信號與端粒PNAFISH雜交信號相重合，表明DNA損傷反應發生在染色體的端粒.在TPP1缺失的ATM+/+細胞中大約50%的細胞中出現至少5個TIF，但ATM敲除（ATM-/-）細胞在TPP1表達抑制后，γH2AX并無顯著改變，也極少見到γH2AX或53BP1在端粒上形成TIF，表明抑制TPP1表達誘導的端粒DNA發生損傷反應依賴于ATM.

【參考文獻】

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