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《分析試驗室》2016年第10期

摘要:

建立了同時提取和測定蔬菜中有機酸與磺胺類抗生素的方法。通過對液相色譜分析條件的優化，建立了以PenomenexC18為分析柱，以0.5%(NH4)2HPO4-H3PO4溶液(pH3.0)為流動相，柱溫30℃，流速1.0mL/min，紫外檢測器檢測波長為210nm和270nm的檢測方法。并比較了水提取，0.1%H3PO4，0.5%(NH4)HPO4，0.5%KH2PO44種不同溶液對有機酸和磺胺的提取效果。結果表明:4種提取方法下，乙酸、檸檬酸提取率無顯著性差異，草酸、蘋果酸、富馬酸、磺胺(SA)、磺胺二甲基嘧啶(SM2)均以水提的效果較好。7種有機酸和2種磺胺類抗生素線性關系良好，檢出限為0.21～1.95ng/g，樣品的加標回收率81.2%～96.2%，相對標準偏差(RSD)小于8.6%，方法適用于蔬菜中有機酸和磺胺類抗生素快速、高效的分離。

關鍵詞:

高效液相色譜;蔬菜;有機酸;磺胺類抗生素

有機酸廣泛存在于植物體內、根際區域和土壤環境中。一方面，有機酸作為水果、蔬菜中的特有成分，它的種類和含量不單決定著果蔬的風味以及品質的好壞，也是果蔬加工貯藏的重要依據。另一方面，當植物處于不良環境中時，植物根系會分泌一些物質(特別是有機酸)以適應脅迫環境，其在環境污染和修復方面發揮著重要作用。磺胺類藥物(SAs)造成土壤污染，孔晶晶等［1］發現，磺胺氯噠嗪鈉、磺胺甲惡唑等磺胺類藥物的吸附能力隨土壤pH的升高而降低，與土壤中有機質和含量呈正相關。朱斐雯等［2］發現，蘋果酸和乙酸是影響磺胺嘧啶在玉米根系土壤中降解的關鍵因素。有機酸影響著污染物從土壤向植物的遷移，對防止SAs類藥物經由植物體吸收進入人體危害人類健康具有重要意義。目前有機酸的測定通常采用氣相色譜法(GC)［3］、離子色譜法(IC)［4，10］、高效液相色譜法(HPLC)。而HPLC操作簡單、準確度高、重現性好，可同時定量測定多種有機酸，已獲得廣泛的應用［5］。檢驗環境中抗生素污染的方法主要有液相色譜分析法和色譜－質譜聯用分析法［6，11］。本文建立了同時測定蔬菜中有機酸和SAs的高效液相色譜分析法，既為判斷植物性食品的品質以及評價SAs隨植物性食品進入食物鏈的風險提供了前提條件［7～9］，也為展開環境中有機酸的動態變化、SAs降解等機理研究提供了理論支撐。

1實驗部分

1.1儀器與材料

Agilent1290液相色譜系統(美國Agilent公司);H-1650臺式高速離心機(上海穗康公司);Milli-Q超純水制備系統(美國Millipore公司);StrataC18-E固相萃取小柱(3mL，Phenomenex)公司;HLB固相萃取小柱(3mL，Phenomenex公司)。7種有機酸標準品(純度＞99%，中國標準物質中心);磺胺(SA)和磺胺二甲基嘧啶(SM2)標準品(純度＞99%，上海阿拉丁公司);乙腈(色譜純);H3PO4，NaOH(AR);K2HPO4，(NH4)2HPO4標準品(純度＞98.5%，國藥集團化學試劑公司);實驗用水均為超純水(18.2MΩ•cm)。

1.2標準溶液配制

準確稱取草酸、蘋果酸、檸檬酸各500.0mg，富馬酸、α－酮戊二酸各50.0mg，用超純水溶解并定容至50mL;準確量取乙酸2.0mL，丙酮酸100μL，用超純水定容至50mL;準確稱取50mgSA，SM2標準品，溶于1mL0.05moL/LNaOH溶液，調節pH至中性，用超純水稀釋定容至50mL，配制成有機酸和磺胺類標準儲備液，在4℃下避光保存，根據實驗需要稀釋成不同濃度的工作溶液。

1.3樣品前處理

將青菜、菠菜葉片用超純水洗凈，擦干，剪碎混勻后各稱取2.50g，加入2.0mL提取液研磨勻漿，將均漿液全部移入50mL離心管中，再用1mL提取液洗滌并轉至離心管，重復3次，總體積為5mL，每組設置平行樣3個，30℃下振蕩提取30min，提取液于12000r/min轉速下離心20min，收集上清液，取上清液過0.22μm濾膜后，待測。

1.4色譜條件

色譜柱:PenomenexC18(150×4.6mm);柱溫:30℃;流動相:A為0.5%(NH4)2HPO4-H3PO4(pH3)緩沖液，B為乙腈;流速為1mL/min;紫外檢測波長210，270nm;進樣量20μL。洗脫梯度見表1。

2結果與討論

2.1色譜條件的優化

2.1.1流動相的選擇

分別采用乙酸－乙腈、KH2PO4－乙腈、(NH4)2HPO4溶液－乙腈作為流動相進行分析測定。結果表明，以乙酸溶液為流動相時，色譜峰不能實現有效分離;以KH2PO4溶液為流動相時，單個化合物出現雙峰;以(NH4)2HPO4為流動相時有機酸和SAs都能得到較好的分離，色譜峰的峰形尖銳，對稱性好。因此，選擇(NH4)2HPO4為流動相。配制了質量分數分別為0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%的(NH4)2HPO4的溶液(用H3PO4調pH3)。色譜分離結果表明，當(NH4)2HPO4溶液為0.5%時，有機酸和SAs均可獲得較好的分離效果和色譜峰形。因此本實驗選擇0.5%(NH4)2HPO4溶液作為流動相。

2.1.2流動相pH、配比的選擇

用H3PO4分別調節流動相pH為2，2.5，3，3.5。結果發現，流動相的pH變化直接影響化合物的分離效果，當流動相pH3時，各化合物獲得最佳分離效果。因此選擇pH3的(NH4)2HPO4溶液。考察了在磷酸鹽緩沖體系中加入有機相對有機酸和SAs的洗脫速度和分離度的影響。有機相中乙腈的含量越高，洗脫速度越快;磷酸鹽的含量越高洗脫速度越慢，分離度越高，因此可以調節乙腈和(NH4)2HPO4的比例將目標峰在較短的時間分離。對于有機酸分離，選擇(NH4)2HPO4(0.5%，pH3):乙腈=100:0(V:V)作為流動相時，7種有機酸在6min內能實現完全分離，各組分間分離度大，峰形尖銳，且對稱性好。對于SAs的分離，選擇(NH4)2HPO4(0.5%，pH3):乙腈=15:85(V:V)作為流動相時，使SA的出峰時間由12min縮短到7.4min，SM2出峰時間由24min縮短到20.7min。有機酸和SAs的標準品的色譜圖如圖1所示。

2.1.3檢測波長、柱溫和柱壓條件

通過紫外檢測器掃描了有機酸和SAs在190～400nm范圍內的吸收，確定有機酸的最大吸收波長為210nm，SAs的最大吸收波長為270nm，因此，選擇檢測波長為210，270nm。選擇了25℃，30℃，35℃3個柱溫進行比較，發現有機酸和SAs的分離均不受柱溫變化的影響，綜合考慮確定柱溫箱溫度為30℃。本實驗所用的HPLC色譜系統柱的最高壓限值為6MPa，為保持在合理范圍內，實驗過程中流速控制在1mL/min，柱壓基本保持不變，范圍在2MPa左右。

2.2提取條件的選擇

2.2.1提取液

考察了蒸餾水、0.1%H3PO4溶液以及不同pH的磷酸鹽溶液對青菜和菠菜中有機酸和磺胺抗生素的提取效果。結果發現，水提取和0.1%H3PO4溶液對青菜和菠菜中有機酸和SAs提取效果較好，而采用不同pH(pH2.2，3，5，6，7，8)的0.5%(NH4)2HPO4和0.5%KH2PO4為提取液時提取率均較低。以蒸餾水和0.1%H3PO4(pH2.2)為提取液時，有機酸的提取率無顯著差異，但蒸餾水直接提取的SAs回收率有所提高。因此，實驗選擇蒸餾水作為提取液。

2.3標準工作曲線

標準樣品質量濃度范圍為0.01～1000mg/L之間，設置10個濃度梯度，在上述色譜條件下進行檢測，以質量(x)與峰面積(y)進行線性回歸，得出各有機酸和SAs的標準曲線(見表2)，相關系數R2＞0.9999，以3倍信噪比(S/N=3)求得7種有機酸的檢出限為0.21～1.95μg/kg，2種SAs的檢測限為0.82～1.08μg/kg，并以線性范圍的下限濃度作為本實驗實測樣品的定量限。結果表明，有機酸和SAs分別在1～1000mg/L和0.01～1mg/L范圍內線性良好，可滿足定量分析的要求。

2.4回收率和精確度

取相同的青菜樣品3組，其中1組作本底，測定各有機酸和SAs的含量;另外2組分別添加2個濃度水平的7種有機酸和2種SAs的混合標準溶液，加標后放置12h進行老化平衡，按1.3節方法進行前處理，每組樣品做6次平行實驗，根據加入標準品的質量濃度與檢出質量濃度計算回收率和相對標準偏差(RSD)，結果見表3。

3結論

建立了一種同時測定蔬菜中有機酸和SAs的高效液相色譜法:7種有機酸和2種SAs在0.01～1000mg/L范圍內線性良好，相關系數R2＞0.9999，有機酸的檢測限為0.21～1.95μg/kg，SAs的檢測限為0.82～1.08μg/kg，本方法準確可靠，提高了靈敏度。分析結果表明，不同提取方法對不同試驗材料的提取效果存在差異，綜合考慮發現采用蒸餾水直接提取的方法既能有效保證有機酸和SAs的提取量，又避免了不同的介質提取帶來的實驗誤差，調高了實驗效率。加標回收率試驗表明，青菜中7種有機酸和2種SAs的回收率在81.2%～96.3%之間，RSD范圍為3.3%～8.6%，可用于蔬菜樣品中有機酸和SAs的檢測。針對市售青菜和菠菜檢測發現，蔬菜中SAs均有檢出，雖然其含量相對較低，但存在潛在的健康風險。

參考文獻：

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［11］張婷婷，王靜靜，鞏志國，等．分析試驗室，2016，35(3):287

作者:徐慧敏 施婷婷 檀華蓉 司雄元 單位:安徽農業大學茶與食品科技學院 安徽農業大學資源與環境學院 安徽農業大學生物科技中心