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《化工與醫藥工程》2017年第1期

摘要：以蛋白質含量為24.97%的沙棘籽粕為原料，對沙棘籽粕進行粉碎，得到過80目標準藥篩的沙棘粉末。將沙棘粉末進行醇提，其最佳工藝如下：乙醇濃度75%、料液比1∶6、提取溫度50℃、提取3次每次60min。然后用堿提酸沉法及雙氧水脫色法對醇提沙棘蛋白進行精制，其工藝參數為：pH=10、料液比1∶12、堿提溫度50℃、堿提3次每次50min、30%雙氧水與堿提液比例1∶20、脫色溫度45℃、脫色時間60min，酸沉pH=5。經過粉碎過篩、醇、堿及脫色三步法提取后，得到了沙棘蛋白產品，其蛋白質純度為84.18%，產品得率為11.39%。

關鍵詞：沙棘籽粕；提取工藝；蛋白質

沙棘又名醋柳、黑刺、酸棘等。為胡頹子科植物沙棘（HippophaerhamnoidsL.）的干燥成熟果實。主要分布在內蒙古、西北地區、西藏等地。是我國傳統的藥食同源植物，為國家食品藥品監督管理總局列出的即是食品又是藥品的物品名單之一。沙棘含有多種生物活性物質和營養成分如黃酮類化合物、甾體、維生素類、糖、脂肪酸類、有機酸類、多酚類化合物以及蛋白質和氨基酸等。由于其獨特的生物活性及營養價值優勢，加之沙棘耐寒、耐旱、耐土壤貧瘠，適合于在我國西北、華北、東北、西南等區域種植的特性，為我國內蒙古、陜西、青海等省市帶來了巨大的經濟效益，沙棘森林資源面積大，但其產業開發研究相對滯后，目前主要體現在對沙棘油的利用上。沙棘籽粕是二氧化碳超臨界萃取后廢棄料，也叫沙棘果渣，長期以來直接丟棄，造成大量的環境污染，或用作動物飼料，沙棘產業化、綜合化利用程度一直較低。研究發現沙棘仔粕中蛋白質含量達20%~25%，該蛋白含有18種氨基酸，包括人體必需的8種氨基酸，而且沙棘蛋白還表現出一定的抗炎活性，但是，這些提取方法只涉及到水溶液中蛋白質的提取率，很少涉及沙棘蛋白的得率。崔淼等采用乙醇法提取研究了沙棘仔粕蛋白質的提取工藝，得到的沙棘蛋產品中蛋白質含量低，僅為55.18％。本研究聯合粉碎過篩，乙醇洗滌和堿提酸沉技術，探討沙棘籽蛋白的最優提取工藝，旨在為沙棘籽粕的綜合利用提供試驗依據。

1材料與方法

1.1材料與試劑

超臨界二氧化碳萃取后的沙棘籽粕由青海康普德有限公司提供

1.2儀器與設備

ZN-10小型高速粉碎機，北京興時利和科技發展有限公司；BiofugeStratos全能臺式高速冷凍離心機，美國ThermoFisherScientific公司；BCD-256KT冰箱，青島海爾股份有限公司；MODULYOD-230冷凍干燥機，美國Thermo公司；HYP-308消化爐，上海纖檢儀器有限公司；KDN-812定氮儀，上海纖檢儀器有限公司。

1.3蛋白質純度測定方法

采用凱氏定氮法。具體方法如下。取樣消化：取待測樣品粉末約0.2g，精密稱定于250mL凱氏定氮管中，加硫酸銅0.5g，硫酸鉀10g，濃硫酸20mL，于消化爐220℃消化1h20min，升溫450℃，消化至溶液澄清后，繼續消化30min，放冷；蒸餾：取上述處理液，加入到凱氏定氮儀進行蒸餾（600g/L的氫氧化鈉為反應液，50mL），用20mL的20g/L硼酸接收液體，硼酸中加入1份甲基紅乙醇溶液（1g/L）與5份溴甲酚綠乙醇溶液（1g/L）的混合指示液2滴，自動吸入蒸餾水250mL，加熱蒸餾4min30s；測定：用0.05mol/L硫酸滴定液滴定至溶液由藍綠色變為灰紫色，將滴定結果用空白試驗校正，每1mL硫酸滴定液（0.05mol/L）相當于1.401mg的拯、氮（N）。每個試樣進行3次重復試驗。試樣中蛋白質的純度按公式（1-1）進行計算。

1.4過篩目數對沙棘籽粕原料中蛋白提取率的影響

取沙棘籽粕原料225g，精密稱定，粉碎處理（功率1.5KW）35s，將沙棘粉末平均分成4份，分別過40、60、80、100目篩，稱定過篩后沙棘籽粕粉末重量，按“1.3項”下方法測定樣品中蛋白質含量。蛋白質提取率計算見公式（1-2）。

1.5沙棘籽粕提取及純化工藝沙棘籽粕

粉碎過篩按料液比加一定濃度乙醇溶液設定溫度、乙醇濃度、時間下提取離心分離殘渣冷凍干燥醇提沙棘蛋白按料液比1∶12加堿液調節pH至10、50℃水浴中攪拌提取40min加1.5%雙氧水50℃下攪拌60min調節pH至等電點離心（4000r/min，20min）沉淀水洗2次調節pH至中性沙棘蛋白。

1.6沙棘蛋白等電點的測定方法稱取一定量醇提沙棘蛋白粉末，1m按為沙棘籽粕質量；1p為沙棘籽粕中蛋白質的百分含量。按料液比1∶12g/mL加堿液，調節pH=10，在50℃水浴中攪拌提取40min。將提取均分為7份，將提取液pH值調至3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0以及6.5，靜置2h，離心（4000r/min，20min），按“1.3項”下方法測定上清液中蛋白質含量，將上清液中蛋白質殘留率最低的pH值為沙棘醇提蛋白的等電點。蛋白質殘留率按公式（1-5）計算。

2結果與分析

2.1過篩目數對沙棘籽粕蛋白含量的影響

由于本文是采用醇洗的方法，而籽粕中含有大量的沙棘殼，沙棘殼的主要成分是不溶于醇的纖維素，蛋白質含量極少，可以先除去籽粕中的沙棘殼。粉碎有助于破壞沙棘籽粕的細胞壁，因此采用粉碎、過篩的前處理方法。沙棘籽粕蛋白質主要集中在沙棘籽里的白色顆粒中，而沙棘籽在提取沙棘籽油后，沙棘殼里還殘留有部分蛋白含量較高的白色顆粒，直接過篩并不能將其分離。因此，先過篩再粉碎會浪費大量的資源，降低了原料的生物利用度。粉碎35s后，分別過40、60、80、100目標準檢驗篩。沙棘籽粕原料中蛋白質的含量為25%，通過簡單的粉碎過篩處理，可以使過篩后的沙棘粉末蛋白質含量達到41%與崔淼等人得到的粉碎過80目篩后沙棘仔粕粉末中蛋白質含量相近。過80目標準藥篩后的沙棘粉末蛋白質含量于大豆中蛋白質的含量相當。粉碎直接將沙棘殼以及沙棘籽粉成細粉，由于細胞結構的因素，白色顆粒的粉碎程度比沙棘殼大，造成殼與細粉粒度的不同，這時再過篩可直接除去蛋白含量極低的沙棘殼。從表1和圖1可以看出，隨著過篩目數的增加，過篩后籽粕沙棘籽粕粉末產品中蛋白質純度增大，蛋白質含量從40目的35.7%增加到100目時的41.5%，增加了16.2%。通過100目篩的沙棘粉末只比通過80目篩的沙棘粉末的蛋白質含量增加了2.%，蛋白質的提取率確降低了17.1%，過篩后沙棘粉末的得率也大大降低，降低幅度高達11.8%。這是因為篩網目數越高，孔徑越小，粒徑大于孔徑的粉末就越多，使篩上殘留更多沙棘籽粕蛋白，降低了過篩蛋白提取率。因此，綜合經濟等因素考慮，粉碎后過80目篩較為適宜。

2.2乙醇濃度對提取結果的影響

提取溫度為50℃、料液比1∶6、提取時間1h的條件下，改變乙醇濃度，在濃度為60%、65%、70%、75%、80%條件下分別進行提取，測定蛋白含量結果見圖2。由圖2可以看出，醇提蛋白質含量及提取率隨乙醇濃度的增加呈先增大后減小的趨勢，乙醇濃度為75%時，得到的醇提蛋白中蛋白質含量最大，可達53.5%，提取率也最高，可達88.5%。乙醇濃度從60%到75%時，糖類、黃酮類化合物、色素等物質不斷溶解，蛋白含量不斷增加。但乙醇濃度高于75%時，籽粕中的醇溶蛋白也不斷溶解，造成蛋白含量降低。然而乙醇濃度過高，會使蛋白質變性。綜合考慮，從單因素乙醇濃度來看，70%~80%乙醇濃度較為適宜。

2.3料液比對提取結果的影響

乙醇濃度為75%、提取溫度50℃、提取時間1h的條件下，改變料液比，在料液比為1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8條件下分別進行提取，測定醇提沙棘蛋白純度及蛋白質提取率見圖3。由圖3可以看出，醇提沙棘蛋白質產品蛋白質純度及提取率都隨料液比的增大呈先增大后減小的趨勢，料液比在1∶6時產品蛋白質純度最高，達50.7%，，而在1∶5時提取率最高，達84.4%。料液比從1∶4到1∶6，醇溶物溶解增加，產品蛋白質純度增大；然而從1∶6以后，蛋白質純度降低，提取率也隨之降低，這是由于乙醇的增加使醇溶蛋白溶解更快，進而導致蛋白質總體含量的降低。過大的料液比在生產中會增加原料運輸壓力[22]，綜合考慮，從單因素料液比來看，選取1∶5~1∶7料液比較為適宜。

2.4提取溫度對提取結果的影響

乙醇濃度為75%、料液比1∶6、提取時間1h的條件下，改變提取溫度，在溫度為30、40、50、60、70℃條件下分別進行提取。隨著溫度的提高，所提沙棘蛋白產品蛋白純度及提取率先增大后減少，溫度在50℃時都出現峰值。溫度的升高有助于糖類、黃酮類等醇溶性物質的溶解，進而使蛋白含量增大。但提取溫度超過50℃時，隨著溫度的升高蛋白質開始變性[23]，從而使提出的蛋白含量降低。因此，從單因素提取溫度來看，選取40~50℃比較適宜。

2.5時間對提取結果的影響

乙醇濃度為75%、料液比1∶6、提取溫度為50℃的條件下，改變提取時間，在提取時間為30、45、60、75、90min條件下分別進行提取。

2.6醇提蛋白等電點

蛋白質是一種帶凈電荷的物質，在等電點時分子間的靜電荷為零，蛋白質間靜電排斥作用最低，從而促使蛋白質聚集、沉淀，導致蛋白質在溶液的含量最低。蛋白質的等電點常作為沉淀蛋白質的重要參考。

2.7醇提蛋白的精制

采用75%乙醇濃度、料液比1∶6、提取溫度50℃、提取時間60min，得到蛋白質純度為53.8%的醇提沙棘蛋白。醇提沙棘蛋白在pH=10的水溶液中溶解，在溶解后的蛋白質水溶液中加入雙氧水脫色，有助于溶液中的分子碰撞，脫色效果明顯。調節脫色堿液pH值至5，溶于堿的成分中絕大部分都是蛋白質，所以此方法提出的蛋白質純度較高。脫色后的脫色蛋白顏色比脫色前好，質地松軟結構疏松。精制后得到的沙棘蛋白其蛋白質純度為84.18%。

3結論

采用粉碎過80目篩處理二氧化碳超臨界提取沙棘油后廢棄的沙棘籽粕，將含量為24.97%的沙棘籽粕經過簡單的粉碎過篩處理，得到的沙棘粉末，其蛋白質的含量提高到40.76%。沙棘粉末經過醇洗后蛋白質含量提高到53.84%，雖然醇法提取制得的沙棘蛋白產品蛋白質純度僅提高了13%，沒有達到濃縮蛋白的要求，但能將沙棘粉末中的一些色素清除，所以對醇提沙棘蛋白采用堿提酸沉及雙氧水脫色后的精制產品的蛋白質純度提高到84.18%，產品的最終得率為11.39%。

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作者：龍曉燕1；龍譚1；劉玉林1；陳益家2 單位：1.西南科技大學生命科學與工程學院，2.綿陽市中醫醫院